Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs
Summary
Toeprinting mål å måle evne til i vitro transkribert RNA til skjemaet oversettelse innvielsen komplekser med ribosomer under en rekke forhold. Denne protokollen beskriver en metode for toeprinting pattedyr RNA og kan brukes til å studere både cap-avhengige og IRES-drevet oversettelse.
Abstract
Oversettelse innvielsen er hastighetsbegrensningen skritt av proteinsyntese, og representerer et nøkkel punkt der celler regulere utdataene protein. Regulering av proteinsyntese er nøkkelen til mobilnettet stressrespons feilregulering er mange sykdomstilstander, som kreft. Selv om mobilnettet stress fører til hemming av global oversettelse av demping cap-avhengige initiation, oversettes for eksempel selektivt visse stressrespons proteiner i en cap-uavhengig måte. Diskret RNA regulatoriske elementer, for eksempel mobilnettet intern ribosom oppføring nettsteder (IRESes), lar for oversettelsen av disse spesifikke mRNAs. Identifikasjon av slike mRNAs og karakterisering av deres regulatoriske mekanismer, har vært et sentralt område i molekylærbiologi. Toeprinting er en metode for studier av RNA struktur og funksjon som gjelder oversettelse innvielsen. Målet med toeprinting er å vurdere muligheten av in vitro transkribert RNA danner stabile kompleksene med ribosomer under en rekke forhold, for å avgjøre hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er involvert i ribosom binding-en pre-markøren for effektiv oversettelse innvielsen. Sammen med andre teknikker, for eksempel western analyse og polysome profilering, gir toeprinting robust karakteristikk av mekanismer for regulering av oversettelse innvielsen.
Introduction
Som oversettelse forbruker mest celleenergien, er det fornuftig at oversettelsen er strengt regulert1. Derimot feilregulering oversettelse- og påfølgende endringer i protein utdata-er ofte observert i stress- og sykdom stater, som kreft1,2. En stor fordel av translasjonsforskning kontroll er hastigheten som cellene kan endre utdataene protein for å svare på ulike stimuli3. Oversettelse forordning representerer derfor en viktig mekanisme som kan påvirke celle overlevelse og død1,2,3. Trinnene av oversettelse er oppstart de fleste sterkt regulert og komplekse3. Kort, inneholder de fleste eukaryotic mRNAs en 5 m7G cap som er nesten alltid viktig for deres oversettelse. Cap-avhengige innvielse krever eukaryote innvielsen faktorer eIF4E, eIF4A og eIF4G (cap-anerkjennelse komplekset) å samhandle med 5′ slutten av mRNA. Det 43S preinitiation ribosomet komplekset, som inneholder eIF2-bundet initiatoren tRNA og eIF3, rekruttert til 5′ slutten av den mRNA via et samspill av eIF4G med eIF3. Preinitiation komplekse antas å skanne mRNA, hjulpet av eIF4A (en RNA helicase) før start codon (august) ligger. 48S initiering komplekse er senere dannet og tRNA leveres i P-området av ribosomet. Til slutt, i 60-årene og 40S ribosom underenheter er forent til 80 initiering komplekse, etterfulgt av oversettelsen forlengelse1,3,4. Derimot omgå intern ribosom oppføring nettsteder (IRESes) behovet for en 5′ cap ved rekruttering 40S ribosomal delenhet direkte til innvielsen codon3. Fysiologiske stress forhold attenuere globale mRNA oversettelsen på grunn av endringer av viktige generelle eukaryote innvielsen faktorer (eIFs). Imidlertid ikke-kanoniske oversettelse innvielsen mekanismene tillatelse for selektiv oversettelse av visse mRNAs som ofte kodes stressrespons proteiner og feilregulering av ikke-kanoniske oversettelse innvielsen er involvert i sykdom stater som kreft 1 , 2. diskret RNA regulatoriske elementer, for eksempel mobilnettet IRESes, tillater for oversettelse av slike mRNAs2,3.
Et spesielt interessant aspekt av translasjonsforskning kontroll er å forstå mekanismene av kanoniske versus ikke-kanoniske oversettelse av en gitt mRNA. Toeprinting er en teknikk som gjør at detaljert mekanistisk studiet av oversettelse innvielsen av bestemte RNAs i vitro. Det overordnede målet med toeprinting er å vurdere muligheten for en RNA rundt å nucleate dannelsen av en oversettelse innvielsen med ribosom under en rekke forhold, for å avgjøre hvilke sekvenser, strukturelle elementer eller tilbehør faktorer er nødvendig for effektiv oversettelse innvielsen. For eksempel kan ribosom rekruttering bli hindret i fravær av en 5′ cap men stimulert av tilstedeværelsen av en IRES.
Prinsippet om teknikken er in vitro transkribere RNA en interesse, ruge det i nærvær av mobilnettet ekstrakter som inneholder oversettelse komponenter (eller renset komponentene) for å tillate innvielsen komplekser form, og å reversere transkribere RNA med en bestemt primer. Stabil RNA-ribosom komplekser får omvendt transkripsjon til stall på 3 kanten av ribosom-den såkalte “toeprint”5,6,7.
I denne protokollen, ribosomal underenheter, eIFs, tRNAs og IRES trans-fungerende faktorer (ITAFs) praktisk formidles av kanin retikulocytt lysate (RRL). En annen fordel med denne protokollen er bruken av en fluorescently-merket primer og fluorescens gel-baserte imager, snarere enn en radiolabeled primer. Dette eliminerer ekstra trinn, inkludert radiolabeling primer, samt tørking gel og utsette det til en intensiverer skjermen. Fluorescerende bandene registreres i sanntid, som gel kjører, slik at større oppløsning. Uncapped X-tilknyttet hemmer av apoptose protein (XIAP) IRES brukes som et eksempel her, selv om avkortet mRNAs kan også analyseres av denne teknikken8.
I motsetning til vestlige analyse, som måler det endelige resultatet av oversettelsesprosessen i celle lysates, er toeprinting i vitro tilnærming til å måle oversettelse innvielsen komplekse formasjon på en RNA. Denne reduksjonistiske gir svært detaljerte studier av underlag eller faktorer som regulerer oversettelse innvielsen (f.eks., avkortet un avkortet mRNA, IRES struktur, tilstedeværelse eller fravær av poly-en hale, bestemmelse av bestemt protein faktorer, osv.). Derfor kan toeprinting brukes til å studere forskjellige moduser av oversettelse8 eller effekten av mRNA strukturer, for eksempel IRESes, på protein syntese9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting er en kraftfull teknikk direkte måle evne til en RNA av interesse å støtte dannelsen av oversettelse innvielsen komplekser under kontrollerte forhold. Denne protokollen beskriver en forenklet teknikk for toeprinting pattedyr RNAs. Kanin retikulocytt lysate (RRL) brukes som en praktisk kilde til initiativtakeren, ribosomer, eIFs tRNA og IRES trans-fungerende faktorer (ITAFs). Eksperimentator gir deres RNA valgfrihet, og kan også supplere toeprinting reaksjon med bestemte kofaktorer å velge sine. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av en naturvitenskap Engineering rådet av Canada-Discovery forskningsstipend (RGPIN-2017-05463) og Canada grunnlaget for innovasjon-John R. Evans ledere Fund (35017), Campus Alberta fornyer programmet og Alberta Miljøverndepartementet Økonomisk utvikling og kommersiell.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
Riferimenti
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
