Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación
Summary
Presentamos un enfoque detallado para realizar la colección de saliva, incluyendo traqueotomía murino y el aislamiento de tres glándulas salivales mayores.
Abstract
Hiposalivación se observa comúnmente en la reacción autoinmune síndrome de Sjögren o siguiente lesión por radiación a las glándulas salivales mayores. En estos casos, quedan preguntas con respecto a la patogénesis de la enfermedad y las intervenciones eficaces. Una técnica optimizada que permite la evaluación funcional de las glándulas salivales es muy valiosa para la investigación terapéutica, disfunción y biología de la glándula exocrine. Aquí, presentamos un enfoque paso a paso para realizar la pilocarpina estimula la secreción de saliva, incluyendo la disección de las glándulas salivales murinas principales tres y traqueostomía. También detallamos la anatomía cabeza y cuello murina apropiada accedida durante estas técnicas. Este enfoque es escalable, permitiendo múltiples ratones ser procesados simultáneamente, mejorando así la eficiencia del flujo de trabajo. Nuestro objetivo es mejorar la reproducibilidad de estos métodos, cada uno de ellos tiene más aplicaciones en el campo. Además de la colección de saliva, discutimos métricas para cuantificar y normalización de la capacidad funcional de estos tejidos. Datos representativos se incluyen de las glándulas submaxilares con función deprimida de la glándula salival 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy).
Introduction
Trastornos de la glándula salival incluyen síndromes de altera o deteriora la secreción hacia la superproducción (sialorrea) o insuficiente (xerostomía e hiposalivación) de saliva1. En ambos casos, hay un interés por mejorar nuestra comprensión de la biología de la glándulas salivales hacia la meta final del desarrollo terapéutico2.
Las glándulas salivales son órganos altamente radiosensibles y a menudo se dañan durante la radioterapia de cáncer cabeza y cuello, hacia la permanente boca seca (xerostomía)3,4. Sin embargo, a diferencia de otros tejidos radiosensibles, índice de rotación de la glándula salival es relativamente baja, y el mecanismo de la pérdida de secreción es mal entendido5,6. En este escenario de lesiones únicas, estrategias de regeneración y protección radiológica de tejido requieren evaluación funcional salival. Experimentalmente, colección de saliva murino es una herramienta especialmente valiosa en la evaluación de la respuesta de la glándula a la radiación y los agentes terapéuticos.
Aquí, presentamos un método para realizar y cuantificar la secreción de saliva estimulada con pilocarpina, un potente agonista muscarínico7. La pilocarpina estimula el sistema nervioso autónomo para inducir la secreción de la glándula8,9. Para completar correctamente esta prueba, una traqueotomía se requiere para asegurarse de que el ratón mantenga una vía aérea patente durante todo el procedimiento y para reducir los riesgos de asfixia y aspiración de secreciones agrupadas en la cavidad oral10.
Este es un procedimiento terminal, culminando en la eliminación de las tres glándulas salivales mayores: parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG). Para los estudios funcionales, glándula pesos se registran y se utilizan a menudo para normalizar saliva medición11,12,13. Esta información es particularmente importante en estudios de radiación, en la que la atrofia de la glándula es un resultado esperado14,15
Hay variabilidad en la literatura con respecto a la secreción de saliva estimulada cómo se realiza y divulga16. Por ejemplo, dosis de pilocarpina en la literatura palmo por lo menos tres órdenes de magnitud17,18,19,20,21,22,23. Aquí, presentamos un protocolo de pilocarpina optimizado de dosis alta con la intención de mejora reproducibilidad en ejecución método, así como proporcionar una plataforma modular de técnicas (traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula) que pueden ser adaptados como necesario.
Además de la demostración del Protocolo, incluimos datos funcionales representativos de flujo de la saliva a las 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy) a la región SMG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentamos un método de varios pasos para evaluar la función de la glándula salival, que puede ser aplicada para el estudio de lesiones de la glándula y terapéutica. Nuestro procedimiento consiste en traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula, que tiene aplicaciones experimentales que soporten un estudio integrado de la biología de la glándula salival. Por ejemplo, traqueotomía murino se ha utilizado para la gestión general de la vía aérea durante procedimientos de obstrucción de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de odontología y el Instituto Nacional de cáncer (NCI) de los institutos nacionales de salud Premio número R56 DE025098, DE027695 UG3 y F30 CA206296 Craniofacial Research (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este trabajo también fue apoyado por la NSF DMR 1206219 y la innovación de la IADR en Premio de Cuidado Oral (2016).
Nos gustaría agradecer al Dr. Eri Maruyama y Andrew Hollomon su asistencia con la colección de saliva. Nos gustaría agradecer su ayuda con la disección de la glándula Weng Pei-Lun. Nos gustaría agradecer a Matthew Ingalls por su ayuda en la preparación de la figura. Nos gustaría agradecer al Dr. Elaine Smolock y Emily Wu lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
Riferimenti
- Bradley, P., O’Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
- Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
- Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
- Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
- Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?. Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
- Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
- Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
- Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
- Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
- Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
- Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
- Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
- Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
- Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
- Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
- Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
- Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516 (2007).
- Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
- Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
- Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
- Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice–the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
- Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65 (2010).
- Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
- Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
- Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
- Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063 (2008).
