Colture organotipiche tridimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari
Summary
Colture organotipiche tridimensionale dell’utricolo murino e coclea in otticamente deselezionare collagene gel morfologia del tessuto innata di riserva, consentono per stimolazione meccanica attraverso la regolazione della rigidità di matrice e consentono il recapito della virus-mediata del gene.
Abstract
Gli organi sensoriali dell’orecchio interno sono difficili da studiare nei mammiferi a causa della loro inaccessibilità di manipolazione sperimentale e osservazione ottica. Inoltre, anche se le tecniche di cultura esistenti consentano perturbazioni biochimiche, questi metodi non forniscono un mezzo per studiare gli effetti della forza meccanica e rigidità dei tessuti durante lo sviluppo degli organi sensoriali dell’orecchio interno. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale dell’utricolo murino intatto e coclea che supera queste limitazioni. La tecnica per la regolazione di una rigidità di matrice tridimensionale qui descritto consente la manipolazione della forza elastica opposte la crescita del tessuto. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per studiare il ruolo delle forze meccaniche durante lo sviluppo dell’orecchio interno. Inoltre, le culture consentono il recapito della virus-mediata del gene, che può essere utilizzato per esperimenti di guadagno e perdita di funzione. Questo metodo di cultura conserva le cellule ciliate innate e sostenere le cellule e serve come alternativa potenzialmente superiore alla tradizionale cultura bidimensionale degli organi sensoriali uditivi e vestibolari.
Introduction
Lo studio della maggior parte degli aspetti dello sviluppo dei mammiferi dell’organo è stato facilitato dai sistemi in vitro . Due metodi principali sono ora utilizzati per la coltura di organi sensoriali vestibolari: digalleggiante1 e aderente2 preparazioni. Entrambi i metodi consentono l’indagine della cellula ciliata vulnerabilità3 e rigenerazione1,4 in vitro. Inoltre, hanno i ruoli inerenti allo sviluppo della tacca5,6, Wnt7,8e fattore di crescita epidermico del recettore (EGFR)9,10 segnalazione cascades nell’orecchio interno stata stabilita, in parte, attraverso l’uso di colture in vitro di epiteli sensoriali. Tuttavia, la differenziazione e la crescita delle cellule sono controllati, non solo attraverso la segnalazione di morfogeni, ma anche attraverso segnali fisici e meccanici, ad esempio Contatti intercellulari, la rigidità della matrice extracellulare e stretching meccanico o costrizione. Il ruolo di tali stimoli meccanici è difficile da indagare nel orecchio interno in via di sviluppo in vivo. Inoltre, metodi esistenti di cultura digalleggiante ed aderente non sono adatti per questo tipo di studi in vitro. Qui descriviamo un metodo per coltura organotypic tridimensionale in collagene gel di rigidità variabile. Questo metodo in gran parte conserva l’architettura in vivo degli organi sensoriali cocleari e vestibolari e consente l’indagine sugli effetti della forza meccanica su crescita e differenziazione11.
Perché stimoli meccanici sono conosciuti per attivare eventi molecolari a valle, come l’ippopotamo signaling pathway12,13,14,15, è importante essere in grado di coniugare lo stimolo meccanico con manipolazioni genetiche e biochimiche. Il metodo di cultura qui descritto consente la consegna virus-mediata del gene e pertanto può essere utilizzato per studiare sia meccaniche che molecolare segnalazione durante lo sviluppo di orecchio interno11.
Protocol
Representative Results
Discussion
I segnali molecolari che mediano crescita e differenziazione dell’orecchio interno durante lo sviluppo sono stati studiati estesamente5,6,7,8,9,10. Tuttavia, le prove ottenute dal sistema utricular modello suggeriscono che meccanici spunti, percepiti attraverso giunzioni delle cellule e l’attivazione di segnalazione Hippo, an…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il dottor A. Jacobo, Dr. J. Salvi e r. Petelski per i loro contributi alla ricerca originale su cui si basa questo protocollo. Ringraziamo anche i lama J. e W. Makmura per assistenza tecnica e la zootecnia. Riconosciamo la sovvenzione NIDCD formazione DC009975 T32, NIDCD concedere R01DC015530, fondo di sviluppo terapeutico Robertson e il fondamento della famiglia Caruso per il finanziamento. Infine, riconosciamo supporto da Howard Hughes Medical Institute, di cui il Dr. Hudspeth è un investigatore.
Materials
| #10 Surgical Blades | Miltex | 4-110 | |
| #5 Forceps | Dumont | 11252-20 | |
| 100 mm Petri dish | Sigma | P5856-500EA | |
| 250 uL large orifice pipette tips | USA Scientific | 1011-8406 | |
| 30 mm glass-bottom Petri dish | Matsunami Glass USA Corporation | D35-14-1.5-U | |
| 4 well plate | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H7904 | |
| 60 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | 123TS1 | |
| Acetic acid | Sigma | 537020 | |
| Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Anti-GFP, chicken IgY fraction | Invitrogen | A10262 | |
| Anti-Myo7A | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Anti-Sox2 Antibody (Y-17) | Santa Cruz | sc-17320 | |
| Bicinchoninic acid assay | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10340 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100017 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F5392 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Glutamine | Sigma | G8540 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Insulin | Sigma | I3536 | |
| Iridectomy scissors | Zepf Medical Instruments | 08-1201-10 | |
| Microinjector | Narishige | IM-6 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Gibco | 70011044 | |
| PBS (1X), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Phenol Red pH indicator | Sigma | P4633 | |
| Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| RFP antibody | ChromoTek | 5F8 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Tabletop vortex | VWR | 97043-562 | |
| Transferrin | Sigma | T8158 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 |
Riferimenti
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