イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。
Summary
フローサイトメトリーをイメージング細胞個々 および地方レベルでの形態学的、機能的変化を検出するための理想的なアプローチを提供します。中断エンドサイトーシス汚染物質にさらされたひと樹状細胞における脂質抗原提示機能を遺伝子発現と蛋白質の売買の形態のデモの複合トランスクリプトームのプロファイルを示した。
Abstract
エンドサイトーシスの蛋白質の形態学的、機能的変化の個体群解析いついてレベルで単一細胞レベルで統計画像解析画像キャプチャの需要のために挑戦しています。この困難を克服するためとを使ってイメージング フローサイトメトリー トランスクリプトーム (RNA シーケンス) をプロファイリング分化 1 d タンパク質 (CD1d) のクラスターの関連付けられている細胞内局在性変化を決定する人間の障害エンドサイトーシス遺伝子発現と脂溶性の共通にさらされた樹状細胞 (Dc)、空気汚染物質ベンゾ ピレン []。CD1d とフローサイトメトリーをイメージングを用いた細胞画像の数千からエンドサイトーシス マーカー Lamp1 蛋白質の共存は、アイデアや ImageJ フィジーを用いて解析したプログラム。共同染色 CD1d と Lamp1 蛋白質と多数の携帯電話画像 CD1d のゲーティング後, 可視化された+Lamp1+の Dc のアイデアを使用しています。BaP 露出マンダーの共局在の強度係数テストどちらられる散布図を使用して、プロットに示されたさらに強化された CD1d と Lamp1 の共存は、ImageJ フィジーを用いた共局在の面積の割合に基づいています。私たちのデータが汚染物質にさらされた人間のトランスクリプトーム変質の障害の機能的予後をサポート、シングル、いついての細胞レベルでのタンパク質共存を測定する有利なインストゥルメンタルとバイオ情報アプローチを提供します。Dc。
Introduction
抗原提示は通常多くの場合形態的特性と抗原提示細胞1,2,3 の表現型プロファイリングを使用して検討されているが、人身売買、細胞内のタンパク質を含む.イメージングと表現方法の利点を統合するには、単一のセルでひと樹状細胞 (Dc) で変更されたタンパク質の共局在を示す人口レベルのイメージング解析プラットフォームをについて説明します。ペプチド抗原提示で主要組織適合複合体 (MHC) クラス I の分子従来 CD8 をアクティブにする小胞体の短いペプチド (8-10 残基) をバインド+ T 細胞、MHC クラス II 分子結合比較的長い間従来の CD4 をアクティブにエンドサイトーシスのコンパートメントにおけるペプチド (~ 20 残基)+ T 細胞1,4。対照的に、脂質特異的 T 細胞はエンドサイトーシス コンパートメント5,6を中心に読み込まれる脂質抗原と CD1 の蛋白質によってアクティブ化されます。脂質抗原提示が脂質代謝脂質代謝7,8,9,10と CD1 の蛋白質代謝産物の機能性脂質のロードの物の供給を必要とします。エンドサイトーシス コンパートメント5,6。この文脈では、脂質抗原提示、特に脂溶性の汚染物質と免疫疾患の環境の露出の調節細胞要因を定義する重要です。本研究では汚染物質の暴露で脂質抗原提示に貢献してエンドサイトーシス蛋白質の売買を決定するためのトランスクリプトーム解析、イメージ プロファイル、およびひと単球由来の Dc の細胞および個体群のイメージング解析を使いました。確かに、この組み合わせのプラットフォームは、細胞内の蛋白質の売買と異なる生物学的プロセスの共存を勉強に適用できます。
技術的には、共焦点顕微鏡を用いて、統計的に検出された細胞1,2,3,11の限られた数の分析、蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーション通常示されました。また、フローサイトメトリーは広く細胞レベル12; 複数のタンパク質の共同染色信号ゲート細胞集団に適用されています。しかし、これは細胞内の蛋白質の共存の詳細な可視化を欠いています。生物的蛋白質ハラーゼの機能を決定するためのプロファイルと分析アプローチをイメージングを取り入れる割合タンパク質共存携帯および人口レベルでの包括的かつ統計的分析を達成するために関連性。CD1d およびリソソーム膜蛋白質 1 (Lamp1) の共存を検出するイメージング フローサイトメトリーを用いて具体的には、本研究ではタンパク質。コードして, 分子の定量解析が難しかった以前いついての規模で演奏されます。本研究で我々 はいついて、個々 の細胞レベルで共同染色細胞数が多いタンパク質ハラーゼの割合を調べるための ImageJ フィジー プログラムを適応しました。具体的には、CD1d タンパク質が、親油性の汚染物質ベンゾ [a] ピレン (BaP)13 にさらされる人間の Dc の後半のエンドサイトーシス コンパートメントで保持された主結論を支持する人口サイズ、強度、共局在領域を測定しました。.この複合携帯と画像解析の人口抑制脂質抗原提示に関連する CD1d Lamp1 共存の再現性の高い、包括的、かつ統計的に有意な結果を提供しました。
BaP 公開人間 Dc のトランスクリプトームは強くエンドサイトーシス脂質代謝と CD1d エンドサイトーシス人身売買された BaP 露出で損なわれること仮説をサポートしました。この仮説をテストするため CD1d、エンドサイトーシスのマーカー、および DC マーカーを含む複数のタンパク質を染色共同 DC 人口の画像をプロフィールにイメージング フローサイトメトリーを適用されます。最後に、共同染色細胞は強度の割合と CD1d と Lamp1 共存のエリアを示す統計的に分析しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
複数の経路と個々 と個体群の細胞活動を統合する難しさを含む広く影響を受けた遺伝子発現のため、変更された遺伝子経路の機能確認は困難です。特にテスト CD1d エンドサイトーシスのコンパートメントに人身売買にイメージング フローサイトメトリーを採用しました。フローサイトメトリーをイメージングには、細胞の変化の測定、複数のタンパク質の細胞内局在の共存の個別デモンス?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はヒトの血液サンプルのロバート Giulitto (Hoxworth 血液センター) を感謝し、博士梁ニュウ遺伝子発現の正常化のための読み取り。また助成金サポートから、国立環境衛生研究所 (ES006096) に感謝し、環境遺伝学 (CEG) パイロット プロジェクト (件名標目等)、国立研究所のアレルギー ・感染症 (AI115358) のセンター (s. h.) の大学シンシナティ大学研究評議会賞 (件名標目等) は、大学のシンシナティ大学の医学コア強化資金 (X. Z)。
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
Riferimenti
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