Integrere Imaging flowcytometri og transkriptom profilering for at vurdere ændrede Endocytic CD1d handel
Summary
Imaging flowcytometri giver en ideel metode til påvisning af de morfologiske og funktionelt ændring af celler på individuelle og befolkningsmæssige niveauer. Forstyrret endocytic funktion for lipid antigen præsentation i forurenende-eksponerede menneskelige dendritiske celler blev demonstreret med et kombineret transkriptom profilering af genekspression og morfologiske demonstration af protein handel.
Abstract
Befolkningsmæssige analyser af de morfologiske og funktionelle ændringer i endocytic proteiner er udfordrende på grund af efterspørgsel af billedoptagelse på en enkelt celle niveau og statistiske billedanalyse på befolkningsmæssige plan. For at overvinde denne vanskelighed, brugte vi imaging flowcytometri og transkriptom profilering (RNA-seq) til at bestemme ændrede subcellulært lokalisering af klyngen af differentiering 1d protein (CD1d) forbundet med nedsat endocytic genekspression i menneskelige dendritiske celler (DCs), som blev udsat for den fælles lipofile luft forurenende benzo [a] pyren. Colocalization af CD1d og endocytic markør Lamp1 proteiner fra tusindvis af celle billeder taget med imaging flowcytometri blev analyseret ved hjælp af ideer og ImageJ-Fiji programmer. Talrige cellulære billeder med co farvede CD1d og Lamp1 proteiner blev visualiseret efter gating på CD1d+Lamp1+ DCs ved hjælp af ideer. Den forbedrede CD1d og Lamp1 colocalization ved BaP eksponering blev finpudset ved hjælp af thresholded scatterplots, testet med Manders koefficienter for Co lokaliserede intensitet, og afbildet baseret på andelen af co lokaliserede områder ved hjælp af ImageJ-Fiji. Vores data give en fordelagtig instrumental og bioinformatic tilgang for at måle protein colocalization på både enkelt og befolkningsmæssige cellulære niveauer, støtte en nedsat funktionel resultatet af transkriptom ændring i forurenende-eksponerede mennesker DCs.
Introduction
Antigen præsentation involverer typisk intracellulær protein menneskehandel, som ofte blev undersøgt ved hjælp af morfologiske karakteristika og fænotypiske profilering af antigen præsentere celler1,2,3 . For at integrere fordelene af billedbehandling og fænotyper metoder, beskriver vi en billeddannelse analyse platform på både enkelt celle og befolkning niveauer til at vise en ændret protein colocalization i menneskelige dendritiske celler (DCs). I peptid antigen præsentation, store histocompatibility complex (MHC) klasse I molekyler binder en kort peptid (8-10 restkoncentrationer) i det endoplasmatiske reticulum at aktivere konventionelle CD8+ T celler, mens MHC klasse II molekyler binder en forholdsvis længere peptid (~ 20 restkoncentrationer) i endocytic rum at aktivere konventionelle CD4+ T-celler1,4. Derimod aktiveres lipid-specifikke T-celler ved CD1 proteiner med lipid antigener indlæst hovedsagelig i endocytic rum5,6. Lipid antigen præsentation kræver levering af lipid metabolitter produceret i lipid metabolisme7,8,9,10 og lastning af funktionelle lipid metabolitter til CD1 proteiner i endocytic rum5,6. I denne forbindelse er forskellige cellulære faktorer modulerende lipid antigen præsentation, især i miljømæssig eksponering af lipofile stoffer og immune lidelser, kritisk skal defineres. I denne undersøgelse brugte vi transkriptom analyse, billede profilering og cellulære og befolkningsmæssige imaging analyse af humane monocyt-afledte DCs for at bestemme endocytic protein handel bidrager til lipid antigen præsentation i forurenende eksponering. Bestemt, denne kombinerede platform kan anvendes til at studere subcellulært protein handel og colocalization i forskellige biologiske processer.
Teknisk, subcellulært protein lokalisering viste normalt bruger Konfokal mikroskopi og statistisk analyseres i et begrænset antal fundne celler1,2,3,11. Derudover er flowcytometri blevet bredt anvendt til gate cellepopulationer med co farves signaler af flere proteiner på en cellulært niveau12; dette mangler imidlertid en detaljeret visualisering af subcellulært protein colocalization. For at opnå en omfattende og statistiske analyser af procentdel protein colocalization på både cellulære og befolkning niveauer, vil vi indarbejde imaging profilering og analyse med henblik på at bestemme funktionerne i protein colocalization med biologiske relevans. Specifikt, vi bruger imaging flowcytometri til at registrere colocalization af CD1d og lysosomale-associerede membranen protein 1 (Lamp1) proteiner i denne undersøgelse. Kvantitativ analyse af colocalized molekyler var tidligere vanskeligt skal udføres på en befolkningsmæssige skala. I denne undersøgelse tilpasset vi ImageJ-Fiji program til at undersøge procentdelen af protein colocalization med et stort antal Co farvede celler både befolkningsmæssige og individuelle cellulære niveau. Specifikt, målte vi Co lokaliserede områder, intensitet og befolkningsmæssige størrelse til støtte for den konklusion, at CD1d proteinet i vid udstrækning blev bibeholdt i slutningen endocytic rum af menneskelige DCs i eksponering for en lipofile forurenende benzo [a] pyren (BaP)13 . Denne kombinerede cellulære og befolkningen imaging analyse fastsat meget reproducerbar, omfattende og statistisk signifikante resultater af CD1d-Lamp1 colocalization relevant for hæmmet lipid antigen præsentation.
Transkriptom af BaP-eksponerede menneskelige DCs støttet kraftigt den hypotese, at endocytic lipid metabolisme og CD1d endocytic menneskehandel blev nedsat i BaP eksponering. For at teste denne hypotese, anvendte vi imaging flowcytometri for at profilere de billeder af DC befolkning, der var Co farves med flere proteiner, herunder CD1d, endocytic markører og DC markører. Endelig var Co farvede celler statistisk analyseres for at påvise procentdelen af intensitet og områder af CD1d og Lamp1 colocalization.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funktionelle bekræftelse af en ændret gen pathway udfordrende, på grund af almindeligt påvirket genekspression, der involverer flere veje og er vanskeligheden at integrere individuelle og befolkningsmæssige cellulære aktiviteter. Vi ansat imaging flowcytometri specifikt prøve CD1d menneskehandel i endocytic rum. Imaging flowcytometri integrerer den befolkningsmæssige måling af celler og individuelle demonstration af subcellulært colocalization af flere proteiner. Konfokal mikroskopi har tidligere givet høj opl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Robert Giulitto (Hoxworth blod center) for menneskelige blodprøver og Dr. Liang Niu til normalisering af genekspression læser. Vi takker også tilskud fra nationale Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for miljømæssige genetik (CEG) pilot projekt (S.H.), National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati University Research Council award (S.H.), og University af Cincinnati College af medicin Enhancement kernefinansiering (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
Riferimenti
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
