نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو
Summary
وهناك نقص كبير من المانحين كبد، وجرى توسيع نطاق معايير المانحين الكبد. وقد وضعت نورموثيرميك السابقين فيفو الكبد التروية (نيفلب) لتقييم وتعديل وظيفة الجهاز. يوضح نموذج الفئران من نيفلب هذه الدراسة واختبارات قدرة سي-الكاتالاز، للتخفيف من حدة الضرر الحفاظ على الكبد.
Abstract
هناك نقص كبير في الكبد اللوجرافتس المتاحة لزرع الأعضاء، وردا على ذلك تم توسيع معايير المانحين. نتيجة لذلك أدخلت نورموثيرميك السابقين فيفو الكبد التروية (نيفلب) كوسيلة لتقييم وتعديل وظيفة الجهاز. نيفلب مزايا كثيرة بالمقارنة مع باردا ونضح سوبنورموثيرميك بما في ذلك خفض الحفاظ على الإصابة، استعادة وظيفة الجهاز العادي في ظل الظروف الفسيولوجية، تقييم لأداء الجهاز، ومنطلقا لإصلاح الجهاز ، يعيد البناء، والتعديل. وقد وصف نماذج نيفلب مورين والخنزير على حد سواء. إظهار نموذج الفئران من نيفلب، واستخدام هذا النموذج لعرض إحدى التطبيقات الهامة – استخدام جزيء العلاجية إضافة إلى بيرفوساتي الكبد. كاتالاز الكسح أنواع (روس) أكسجين تفاعلية ذاتية وأظهرت انخفاض الاسكيمية-ضخه في العين والمخ، والرئة. لقد ثبت بيجيليشن لاستهداف كاتالاز إلى البطانة. هنا، لقد أضفنا سي-كاتالاز (شماعة-CAT) إلى بيرفوساتي قاعدة وأثبت قدرته على التخفيف من حدة الضرر الحفاظ على الكبد. ميزة لنموذجنا نيفلب القوارض أنها غير مكلفة بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الكبيرة. حد من هذه الدراسة أن ذلك لا يشمل حاليا التروية بعد زرع الكبد. ولذلك، لا يمكن جعل التنبؤ بمهمة زرع ما بعد على وجه اليقين. ومع ذلك، نموذج عملية زرع كبد الفئران هي راسخة والتأكيد يمكن استخدامها بالاقتران مع هذا النموذج. وفي الختام، لقد أظهرنا طراز نيفلب بسيطة وغير مكلفة، يمكن تكرارها بسهولة باستخدام الفئران. يمكن أن تتضمن تطبيقات لهذا النموذج اختبار perfusates الرواية والمضافات بيرفوساتي والبرمجيات المصممة لتقييم جهاز اختبار وتجارب تهدف إلى إصلاح الأجهزة.
Introduction
وهناك 14,578 المرضى على قائمة الانتظار لزرع الكبد وزرع حوالي 7,000 تتم كل سنة1،2. ردا على هذا النقص كبير من المانحين، اتسع نطاق معايير المانحين الكبد؛ هذه هي غالباً ما يشار إلى أجهزة هامشية أو المعايير الموسعة من الجهات المانحة، ومن المتوقع أن أداء أقل بعد زرع الأعضاء من allografts المعايير القياسية، مع ارتفاع معدلات الخلل الأساسي الابتزاز والفساد تأخر الدالة3، 4،،من56. نتيجة لذلك بدأ نيفلب كوسيلة لتقييم وتعديل الجهاز وظيفة6،7. لدينا تصميم نموذج الفئران من نيفلب ويستخدم هذا النموذج لشرح أحد تطبيقاتها المحتملة الهامة – اختبار المضافات جزيء رواية للكبد بيرفوساتي.
وقد تم تقييم نيفلب في الفئران (فأر) ونماذج الخنزير، وكذلك في الأعضاء البشرية المهملة6،،من89. أيضا في الآونة الأخيرة كانت نتائج التجارب البشرية الأولى من نيفلب نشرت10. على الرغم من نضح آلة باردا أصبح من الواضح القياسية للمحافظة على الكلي، درجة الحرارة في الجهاز الكبد الذي ينبغي أن يحدث نضح لا تزال مثيرة للجدل. وقد نيفلب العديد من المزايا المقترحة بالمقارنة مع باردا ونضح سوبنورموثيرميك. وتشمل هذه المحافظة على انخفاض الإصابة، استعادة وظيفة الجهاز العادي في الظروف الفسيولوجية، القدرة على تقييم أداء الجهاز، ومنطلقا لإصلاح الجهاز ويعيد البناء والتعديل7،11، 12،13،،من1415،،من1617.
أنجز عدد كبير من الدراسات استخدام الخنزير نيفلب النماذج. على الرغم من أن هذه النماذج غير مكلفة نسبيا عند النظر في نماذج استخدام تجاهل الأعضاء البشرية أو التجارب السريرية البشرية، مكلفة للغاية بالمقارنة مع نموذجنا نيفلب الحيوانات الصغيرة. عنصرا هاما لكل تجربة هي التكلفة بيرفوساتي. أننا قادرون على إكمال نضح ح 4 مع 300 مل من بيرفوساتي بتكلفة منخفضة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، تكلفة الحيوانات الصغيرة بما في ذلك الفئران منخفض جداً بالمقارنة مع تكلفة الخنازير.
بالمقارنة مع نماذج أخرى من نيفلب في الفئران، هو بسيط نسبيا لتنفيذ النموذج المعروض هنا وطائفة واسعة من التطبيقات. حلبة نضح يتبين في الشكل 1. ويبدأ بيرفوساتي في خزان بيرفوساتي (1)، الذي يعتبر بمثابة حاوية تغلف مياه. يتم سحبها من الخزان بمضخة اسطوانة (2) بيرفوساتي ودفعت إلى ويندكيسيل (3)، ومن ثم مكساج (4). يتم تعيين مكساج للغاز كونتيركورينت وتدفق بيرفوساتي لتوفير تبادل الغازات كحد أقصى. لفائف بيرفوساتي ثم العائدات لتدفئة (5) داخل قاعة نضح للتأكد من أنه في درجة حرارة الفسيولوجي، وفخ فقاعة (6) لمنع التروية لفقاعات الهواء هناك الجهاز السابق (7) والجهاز بعد (8) المنافذ العينة، والتي تسمح بيرفوساتي أن يكون عينات. ثم يدخل بيرفوساتي في الكبد عن طريق الوريد البابي القنية. قنية الوريد البابي موصولة إلى جهاز ضغط المخططات القيم على برامج جمع البيانات. ثم بيرفوساتي خروج الكبد من خلال قنية IVC ويتدفق إلى كتلة ضغط التعادل (9). وأخيراً، بيرفوساتي انسحب من كتلة الضغط مرة أخرى عن طريق المضخة الدوارة وإفراغ خزان. هذا النموذج يتضمن التروية المستمرة الوريد البابي ويترك تدفق نابض بالشريان الكبدي والغسيل الكلوي المستخدمة في بعض النماذج الأخرى، كل منها يتطلب دارة منفصلة وإضافية، ولكن أثبتت سابقا أن لا تكون مطلوب9،13.
استكشاف إضافة جزيء العلاجية الرواية إلى بيرفوساتي، اخترنا في إنزيم الكاتالاز. الكاتلاز هو الكاسح روس ذاتية التي جزء من إليه الدفاع الخلايا الداخلية التخفيف من آثار روس18. يتم زيادة التعبير كاتالاز في الاسكيمية كبدي ضخه إصابة19. قد تجلى التجريبية إضافة كاتالاز إنقاص الاسكيمية-ضخه في العين والمخ، والرئة20،،من2122،،من2324. لقد ثبت بيجيليشن لاستهداف كاتالاز إلى البطانة والمساعدة في امتصاص كاتالاز إلى خلايا بطانية25. القط شماعة تدير عناصره مع فعالية محدودة في الحد من الإصابات الكبدية الاسكيمية-الاكسجينيه؛ ومع ذلك، افترضنا أن إضافة شماعة-القط إلى حلبة نضح جهاز معزولة أن يؤدي إلى تحسين النتائج26،،من2728. هنا، نحن إضافة الوتد-القط أن لدينا قاعدة بيرفوساتي وإثبات قدرته التخفيف من الضرر الحفاظ على الكبد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك نقص كبير في الكبد اللوجرافتس المتاحة للزرع واستجابة معايير المانحين الموسعة1،2،3،،من45. وقد أدخلت نيفلب نتيجة للنقص في الجهات المانحة، كوسيلة لتقييم وتعديل الجهاز وظيفة6،<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل أيده 106704-01A1 T32AI المعاهد الوطنية للصحة والصندوق زادت “ت.” لزرع الأعضاء ونضح والهندسة والتجديد في “جامعة ولاية أوهايو”.
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
Riferimenti
- . National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017 Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- . National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 – December 31, 2016, For Organ = Liver Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells?. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
