طراز ماوس تشيميريك كبد البشري الكوليستيرول أسرية باستخدام خلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لإنشاء نموذج ماوس تشيميريك كبد البشري من الكوليستيرول الأسرية باستخدام خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent. وهذا نموذجا قيماً لاختبار علاجات جديدة الكوليستيرول.
Abstract
معظمها بسبب طفرات مستقبلات (لدلر) low-density lipoprotein الكوليستيرول الأسرية (FH) ويؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بأمراض القلب والشرايين بداية مبكرة بسبب الارتفاع الملحوظ الكولسترول الضار (LDL-C) في الدم. Statins السطر الأول من الأدوية الخافضة للدهون لعلاج FH وأنواع أخرى من الكوليستيرول، ولكن نهج جديدة آخذة في الظهور، في أجسام PCSK9 خاصة، والآن يجري اختبارها في التجارب السريرية. لاستكشاف النهج العلاجية رواية FH, أدوية جديدة أو تركيبات جديدة، نحن بحاجة إلى مناسبة في فيفو نماذج. ومع ذلك، الاختلافات في الملامح الأيض الدهون مقارنة بالبشر مشكلة رئيسية للنماذج الحيوانية المتاحة من FH. لمعالجة هذه المسألة، ونحن قد ولدت نموذجا ماوس تشيميريك كبد البشري باستخدام الخلايا الجذعية pluripotent FH التي يسببها (اللجنة التوجيهية)-اشتقاق خلايا الكبد (عبس). كنا الفئران لدلر-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (lrg صندوق) لتفادي الرفض المناعي لزرع الخلايا البشرية وتقييم تأثير لدلر-عبس ناقصة في لدلر فارغة الخلفية. يمكن إعادة زرع FH عبس ملء 5-10% الكبد الماوس lrg صندوق استناداً إلى تلطيخ الزلال البشري. وعلاوة على ذلك، إيهيبس انجرافتيد تستجيب للأدوية الخافضة للدهون ولخص الملاحظات الإكلينيكية لزيادة فعالية الأجسام المضادة PCSK9 مقارنة مع statins. وهكذا يمكن أن يكون نموذجنا تشيميريك الكبد البشري مفيدة للتجارب السريرية للعلاجات الجديدة إلى FH. استخدام البروتوكول نفسه، ومشابهة من الفئران تشيميريك الكبد البشري للمتغيرات الجينية FH الأخرى، أو الطفرات المقابلة لغيرها من أمراض الكبد الموروثة، قد يتم أيضا إنشاء.
Introduction
مستقبلات low-density lipoprotein (لدلر) تلتقط الكولسترول الضار (LDL-C) في الدم تعدل توليف الكولسترول في الكبد. الطفرات في الجينات لدلر هي السبب الأكثر شيوعاً الكوليستيرول الأسرية (FH)1. Statins تقليديا في السطر الأول من الأدوية لعلاج FH وأنواع أخرى من الكوليستيرول (موروثة أو مكتسبة). Statins تمنع 3-هيدروكسي-3-ميثيلجلوتاريل-إنزيم ريدكتيز إلى انخفاض تخليق الكوليسترول في الكبد2. بالإضافة إلى ذلك، statins زيادة مستويات لدلر على السطح تتمثل لتعزيز البلازما إزالة LDL-C. تحذير رئيسية للمعاملة مع الستاتين غير أنها حمل في نفس الوقت التعبير عن كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/هيكسين 9 (PCSK9)، إنزيم يربط لدلر النهوض تدهور3. هذا التأثير المسؤول عن الاستجابة غير كافية أو null حتى statins لوحظ في العديد من المرضى. دراسة هذه الآلية، بشكل غير متوقع، أدى إلى اكتشاف طريقة بديلة لعلاج الكوليستيرول. أضداد PCSK9 التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير مؤخرا تستخدم حاليا في التجارب السريرية، وإظهار كفاءة أعلى والتسامح أفضل من statins4. نجاح PCSK9 الأجسام المضادة يعني أيضا أنه قد تكون هناك إمكانيات أخرى علاجية لتعديل مسار التدهور لدلر (إلى جانب PCSK9) في المرضى الذين يعانون من الكوليستيرول. وبالمثل، هناك اهتمام بتطوير مثبطات جديدة من PCSK9 خلاف الأجسام المضادة، على سبيل المثال، siRNA أوليجوس5.
لاختبار علاجات جديدة FH وعامة أخرى على أي نوع من الكوليستيرول، نماذج مناسبة في فيفو ضرورية. مشكلة رئيسية من الحالي في فيفو نماذج، ومعظمهم من الفئران6 والأرانب7، هي تلك الاختلافات الفسيولوجية مع البشر. من الأهمية بمكان هذه المشاكل تشمل ملف تعريف الأيض الدهون مختلفة. الجيل من الحيوانات تشيميريك الكبد البشري8 قد تساعد في التغلب على هذا التحذير. الماوس تشيميريك الكبد البشري نوع من “أنسنة” الماوس مع الكبد في إعادة ملء مع خلايا الكبد البشري، على سبيل المثال، خلايا الكبد البشري الأساسي (pHH)9. مشكلة مع pHH أنه لا يمكن توسيع فيفو السابقين، بسرعة تفقد وظيفتها على العزلة، ومصدر محدود. بديل ل pHH هو استخدام الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية)-اشتقاق خلايا الكبد (إيهيبس)10. جدير بالذكر أن إيبسكس الخاصة بالمريض ويمكن زراعتها إلى أجل غير مسمى، حيث يمكن أن تنتج عبس على الطلب، وميزة كبيرة على مدى pHH الطازجة. وعلاوة على ذلك، إيبسكس يمكن أيضا أن تكون بسهولة وراثيا مع nucleases مصمم لتصحيح أو استحداث الطفرات في اسوي خلفية للسماح بإجراء مقارنات أكثر إخﻻصا11.
الماوس تشيميريك الكبد البشري مع pHH انجرافتيد إظهار أوجه الشبه للبشر في التشكيلات الجانبية الأيضية للكبد، واستجابات المخدرات، والقابلية ل الإصابة بفيروس التهاب الكبد12. وهذا يجعلها نموذجا جيدا لدراسة الدهون في الجسم الحي. تستند النماذج الأكثر استخداماً الماوس الماوس فاه-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG)13 والتحالف التقدمي المتحد الماوس المعدلة وراثيا8، التي تصل إلى 95 في المائة الماوس في الكبد يمكن الاستعاضة عن pHH. من المثير للاهتمام، وصف تقرير حديث لبشرية FH كبد تشيميريك ماوس (استناداً إلى الماوس الغواتيمالية) مع pHH من مريض تحمل تحور لدلر متماثل14. في هذا النموذج، خلايا الكبد البشري repopulated قد لا لدلر الوظيفية، ولكن خلايا الكبد الماوس المتبقية، مما يقلل من فائدة للأداء في فيفو اختبار العقاقير الاعتماد على المسار لدلر.
هنا، نحن تقرير بروتوكول مفصل استناداً إلى الأعمال المنشورة مؤخرا لدينا15 انجرافتينج عبس FH في الكبد الماوس لدلر-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (lrg صندوق). هذا الفأر تشيميريك الكبد البشري مفيد للنمذجة FH وإجراء اختبار المخدرات المجراة في.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أكدت دراسات السابقة باستخدام إيهيبس في القوارض فوسيلة فعالة لدراسة أمراض الكبد الموروثة17. لزيادة التوسع في استخدام هذه التكنولوجيا، ونظرا للنماذج الحيوانية FH الحالية دون المستوى الأمثل، ونحن انجرافتيد إيهيبس FH في الفئران lrg صندوق، وأظهرت أن انجرافتيد لدلر +/–أو متخ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا العمل شنتشن للعلوم و “التكنولوجيا مجلس البحوث البرنامج الأساسي” (JCYJ20150331142757383)، برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDA16030502)، “هونغ كونغ البحث منحة المجلس الموضوع على أساس البحث” مخطط (T12-705/11)، برنامج تعاون مجلس منح الأبحاث لمنطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية مشروع فريق البحث (N-HKU730/12 و 81261160506)، الصين للعلوم الطبيعية في قوانغدونغ مؤسسة (2014A030312001)، والعلم قوانغتشو وبرنامج التكنولوجيا (201607010086)، ومقاطعة قوانغدونغ العلم والتكنولوجيا برنامج (2016B030229007 و 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
Riferimenti
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
