Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine menschliche Leber chimärer Maus-Modell der Familiäre Hypercholesterinämie mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu generieren. Dies ist ein wertvolles Modell zum Testen neuer Therapien für Hypercholesterinämie.
Abstract
Familiäre Hypercholesterinämie (FH) wird meist von geringer Dichte Lipoprotein (LDLR)-Rezeptor-Mutationen verursacht und führt zu einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen früh einsetzende durch deutliche Erhöhung von LDL-Cholesterin (LDL-C) im Blut. Statine sind die erste Zeile von lipidsenkenden Medikamenten zur Behandlung von FH und andere Arten von Hypercholesterinämie, aber neue Ansätze entstehen in bestimmten PCSK9-Antikörpern, die nun in klinischen Studien getestet werden. Um neue therapeutische Ansätze für FH, neue Medikamente oder neue Rezepturen erforschen müssen wir in Vivo Modelle geeignet. Bestehen jedoch Unterschiede in der Lipid-Stoffwechselprofile im Vergleich zu Menschen ein zentrales Problem der verfügbaren Tiermodellen der FH. Um dieses Problem zu beheben, haben wir eine menschliche Leber chimärer Mausmodell mit FH induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) erzeugt-Hepatozyten (iHeps) abgeleitet. Wir verwendeten/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) Mäuse Immunabwehr von transplantierten menschlichen Zellen zu vermeiden und Beurteilung der Wirkung des LDLR-mangelhafte iHeps in ein LDLR null Hintergrund. Transplantierten FH iHeps könnte wieder zu bevölkern ca. 5-10 % der LRG Maus Leber basierend auf menschliches Albumin-Färbung. Darüber hinaus die eingepflanzt iHeps reagierte auf Lipidsenker und rekapitulierte klinische Beobachtungen der erhöhte Wirksamkeit der PCSK9 Antikörper gegenüber Statinen. Unsere menschlichen Leber Chimäre Modell könnte somit für präklinischen Erprobung neuer Therapien zur FH nützlich sein. Mit dem dasselbe Protokoll, ähnlich wie menschliche Leber chimeric Mäuse für andere FH genetische Varianten oder Mutationen, die entsprechend andere erblichen Erkrankungen der Leber kann auch generiert werden.
Introduction
Low density Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) fängt LDL-Cholesterin (LDL-C) im Blut, Cholesterinsynthese in der Leber zu modulieren. Mutationen im LDLR-Gen sind die häufigste Ursache für Familiäre Hypercholesterinämie (FH)1. Statine wurden traditionell die erste Zeile von Medikamenten zur Behandlung von FH und andere Arten von Hypercholesterinämie (vererbt oder erworben). Statine hemmen 3-hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym eine Reduktase Cholesterinsynthese in der Leber2zu senken. Darüber hinaus erhöht die Statine LDLR-Ebenen auf der Oberfläche der Hepatozyten, Plasma LDL-C-Abstand zu fördern. Eine große Einschränkung der Behandlung mit Statinen ist jedoch, dass sie gleichzeitig induzieren die Expression von proprotein Konvertase Subtilisin/hexin 9 (PCSK9), ein Enzym, das LDLR bindet seinen Abbau3zu fördern. Dieser Effekt ist verantwortlich für die unzureichende oder sogar null Reaktion auf Statine bei vielen Patienten beobachtet. Dieser Mechanismus zu studieren, unerwartet, zur Entdeckung der eine alternative Möglichkeit zur Behandlung von Hypercholesterinämie führte. PCSK9-Antikörper, die kürzlich von der FDA zugelassen sind derzeit in klinischen Studien eingesetzt und zeigen höhere Wirksamkeit und bessere Verträglichkeit als Statine4. Der Erfolg von PCSK9 Antikörpern impliziert auch, dass möglicherweise gibt es andere Therapiemöglichkeiten den LDLR-Abbau-Weg (neben PCSK9) bei Patienten mit Hypercholesterinämie zu modulieren. Ebenso gibt es Interesse an der Entwicklung neuer Inhibitoren des PCSK9 als Antikörper, z. B. SiRNA Oligos5.
Um zu testen, neue Therapien für FH und im Allgemeinen jede andere Art von Hypercholesterinämie, sind geeignete in-Vivo -Modelle notwendig. Ein Hauptproblem der aktuellen in-Vivo -Modelle, meist Mäuse6 und7, Kaninchen sind ihre physiologische Unterschiede mit den Menschen. Entscheidend ist, gehören diese Probleme eine unterschiedliche metabolische Lipidprofil. Die Generation der menschlichen Leber Chimären Tiere8 könnte helfen, diese Einschränkung zu überwinden. Die menschliche Leber Chimäre Maus ist eine Art von “humanisierte” Maus mit seiner Leber aufgefüllt mit humanen Hepatozyten, z. B. primären humanen Hepatozyten (pHH)9. Ein Problem mit pHH ist, dass sie schnell erweiterte Ex Vivo, nicht verlieren ihre Funktion bei der Isolierung und eine begrenzte Quelle sind. Eine Alternative zu pHH ist die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleitet von Hepatozyten (iHeps)10. Vor allem iPSCs sind patientenspezifischen und auf unbestimmte Zeit, so dass iHeps on Demand produziert werden kann, ist ein wesentlicher Vorteil gegenüber frischen pHH angebaut werden können. Darüber hinaus können iPSCs auch leicht gentechnisch werden mit Designer Nukleasen zu korrigieren oder Mutationen in einem isogenen Hintergrund erlauben mehr Treue Vergleiche11vorstellen.
Menschlichen Leber chimärer Maus mit eingepflanzt pHH zeigen Ähnlichkeiten zu den Menschen in der Leber Stoffwechselprofile, Medikament Antworten und Anfälligkeit für Hepatitis-Virus-Infektion-12. Dadurch haben sie ein gutes Modell, Hyperlipidämie in Vivozu studieren. Die am häufigsten verwendete Mausmodelle basieren auf der/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (BRD) Maus13 und der uPA transgenen Maus8, in dem bis zu 95 % der Maus Leber durch pHH ersetzt werden kann. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschriebenen Interessanterweise eine menschliche Leber FH Chimäre Maus (bezogen auf die BRD-Maus) mit pHH von einem Patienten mit einem homozygot LDLR Mutation14. In diesem Modell Waldlandschaften humanen Hepatozyten hatte keine funktionale LDLR, aber die restlichen Maus Hepatozyten haben, wodurch das Dienstprogramm für die Durchführung von in-Vivo Tests von Medikamenten unter Berufung auf die LDLR-Weg.
Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll basierend auf unserer kürzlich veröffentlichtes Werk15 für FH-iHeps in die/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) Maus Leber Einpflanzen. Diese menschlichen Leber chimärer Maus eignet sich für die FH Modellierung und Durchführung von Drogentests in-vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frühere Studien mit iHeps bei Nagetieren haben bestätigt, dass sie ein wirksames Mittel zur Leber Erbkrankheiten17zu studieren sind. Weiter erweitern den Einsatz dieser Technologie und weil aktuelle FH Tiermodelle suboptimal sind, wir pfropfte FH iHeps in LRG Mäuse und zeigte, dass die eingepflanzt LDLR + / oder heterozygot LDLR-mutierte FH iHeps können Mäuse Plasma LDL-C Ebene reduzieren und reagieren auf Lipid-senkende Medikamente in Vivo.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Shenzhen Science and Technology Rat Basic Research Program (JCYJ20150331142757383), strategische Priorität Forschungsprogramm der chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Rates Theme Based Research unterstützt. Schema (T12-705/11), Kooperationsprogramm von Zuschüssen Forschungsrat der Sonderverwaltungsregion Hongkong und die National Natural Science Foundation von China (N-HKU730/12 und 81261160506), Team Forschungsprojekt der Guangdong-Naturwissenschaft Stiftung (2014A030312001), Guangzhou Wissenschaft und Technologie-Programm (201607010086), Provinz Guangdong Wissenschaft und Technologieprogramm (2016B030229007 und 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
Riferimenti
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