Un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar con hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Este es un modelo valioso para probar nuevos tratamientos para la hipercolesterolemia.
Abstract
Hipercolesterolemia familiar (FH) en su mayoría es causado por mutaciones de lipoproteína de baja densidad (LDLR) del receptor y los resultados en un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular inicio temprano debido a la marcada elevación del colesterol de LDL (LDL-C) en sangre. Las estatinas son la primera línea de fármacos hipolipemiantes para el tratamiento de FH y otros tipos de hipercolesterolemia, pero están surgiendo nuevos enfoques, en particular anticuerpos PCSK9, que ahora se están probando en ensayos clínicos. Para explorar nuevos enfoques terapéuticos para FH, nuevos fármacos o nuevas formulaciones, necesitamos apropiados modelos en vivo . Sin embargo, las diferencias en los perfiles metabólicos de lípidos en comparación con los seres humanos son un problema clave de los modelos animales disponibles de FH. Para solucionar este problema, hemos generado un modelo de ratón quimérico hígado humano usando la célula de vástago de pluripotent FH inducida (iPSC)-derivado de hepatocitos (iHeps). Se utilizaron ratones/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) para evitar el rechazo inmune de las células humanas trasplantadas y a evaluar el efecto del LDLR-iHeps deficientes en un LDLR nulo fondo. IHeps FH trasplantado podría repoblar 5-10% del hígado de ratón LRG, basado en la coloración de la albúmina humana. Además, el iHeps implantada había respondido a fármacos hipolipemiantes y recapituló las observaciones clínicas de la eficacia creciente de anticuerpos PCSK9 en comparación con las estatinas. Nuestro modelo quimérico hígado humano así podría ser útil para la prueba preclínica de terapias nuevas para FH. También se puede generar utilizando el mismo protocolo, ratones quiméricos hígados humanos similares para otras variantes genéticas de FH o correspondientes a otras enfermedades hepáticas hereditarias, mutaciones.
Introduction
Receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR) captura el colesterol LDL (LDL-C) en sangre para modular la síntesis de colesterol en el hígado. Mutaciones en el gen LDLR son la causa más frecuente de hipercolesterolemia familiar (FH)1. Las estatinas han sido tradicionalmente la primera línea de medicamentos para tratar el FH y otros tipos de hipercolesterolemia (heredado o adquirido). Las estatinas inhiben la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima reductasa para reducir la síntesis del colesterol en el hígado2. Además, las estatinas aumentan los niveles de LDLR en la superficie del hepatocito para promover la separación de C-LDL del plasma. Sin embargo, una advertencia importante del tratamiento con estatinas es que al mismo tiempo inducen la expresión de cualquiera convertasa subtilisin/hexin 9 (PCSK9), una enzima que se une a LDLR para promover su degradación3. Este efecto es responsable de la insuficiente o incluso nula respuesta a las estatinas observadas en muchos pacientes. Estudiar este mecanismo, inesperadamente, lleva al descubrimiento de una forma alternativa para tratar la hipercolesterolemia. PCSK9 anticuerpos recientemente aprobados por la FDA en la actualidad se están utilizando en ensayos clínicos y mostrar mayor eficacia y mejor tolerancia que las estatinas4. El éxito de PCSK9 anticuerpos también implica que puede haber otras posibilidades terapéuticas para modular la vía de degradación de LDLR (además de PCSK9) en pacientes con hipercolesterolemia. Asimismo, existe interés en el desarrollo de nuevos inhibidores de PCSK9 distintos anticuerpos, por ejemplo, siRNA oligos5.
Para probar terapias nuevas para FH y en general cualquier otro tipo de hipercolesterolemia, apropiado en vivo modelos son necesarios. Un problema importante de la actual en vivo modelos, sobre todo ratones de6 y7, de conejos son sus diferencias fisiológicas con los seres humanos. Fundamentalmente, estos problemas incluyen un perfil metabólico de lípidos diferentes. La generación de animales quiméricos hígado humano8 podría ayudar a superar esta advertencia. El ratón quimérico hígado humano es un tipo de ratón “humanizado” con su hígado con hepatocitos humanos, por ejemplo, hepatocitos primarios humanos (pHH)9. Un problema con pHH es que no puede ser ampliada ex vivo, rápidamente pierden su función al aislamiento, y son una fuente limitada. Una alternativa a HPH es el uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-derivado de hepatocitos (iHeps)10. En particular, iPSCs son específicos para cada paciente y puede crecer indefinidamente, por lo que iHeps puede ser producido según la demanda, que es una ventaja significativa sobre HPH fresco. Por otra parte, iPSCs puede también ser fácilmente genéticamente modificados con nucleasas diseñador para corregir o introducir mutaciones en un segundo plano isogénicas para permitir comparaciones más fiel11.
Ratón quimérico hígado humano con pHH engrafted demuestran semejanzas a los seres humanos en perfiles metabólicos hígados, drogas respuestas y susceptibilidad a virus de hepatitis infección12. Esto los hace un buen modelo para el estudio de la hiperlipidemia en vivo. Los modelos de ratón más utilizados se basan en la/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (RFA) ratón13 y la uPA Ratón transgénico8, en que hasta el 95% del ratón hígado puede reemplazarse por pHH. Curiosamente, un informe reciente describió un humano FH hígado quimérico ratón (basado en el ratón de la RFA) con pHH de un paciente que llevaba una de mutación homocigótica de LDLR 14. En este modelo, los hepatocitos humanos repoblados no tenían funcional LDLR, pero hicieron los hepatocitos ratón residual, reduciendo así la utilidad de realizar en vivo pruebas de drogas confiando en el camino del LDLR.
Aquí, Divulgamos un protocolo detallado basado en nuestro trabajo recientemente publicado15 de engrafting FH iHeps en el hígado de ratón/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG). Este ratón quimérico hígado humano es útil para modelos FH y la realización de pruebas de drogas en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudios previos usando iHeps en roedores han confirmado que son una manera eficaz para el estudio de enfermedades hepáticas hereditarias17. Aún más ampliar el uso de esta tecnología y porque los modelos animales de FH actuales son subóptimos, engrafted FH iHeps en ratones LRG y demostró que la implantada LDLR +- o heterozigótica LDLR-iHeps FH mutado puede reducir el nivel de C-LDL del plasma de ratones y responder a la reducción de lípidos drogas en vivo.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Shenzhen Ciencia y tecnología Consejo básico programa de investigación (JCYJ20150331142757383), programa de investigación prioridad estratégica de la Academia China de Ciencias (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Consejo tema investigación Esquema (T12-705/11), programa de cooperación del Consejo de becas de investigación de la región administrativa especial de Hong Kong y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (N-HKU730/12 y 81261160506), equipo proyecto de investigación de Ciencias naturales de Guangdong Fundación (2014A030312001), Guangzhou ciencia y tecnología programa (201607010086) y la provincia de Guangdong programa ciencia y tecnología (2016B030229007 y 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
Riferimenti
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