Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes
Summary
Aquí, presentamos un protocolo utilizar inyección guiada por ultrasonido de las células de (ES) el sarcoma de Ewing y neuroblastoma (NB) (estableció líneas celulares y células tumorales derivados del paciente) en sitios biológicamente relevantes para crear modelos preclínicos fiables para el cáncer investigación.
Abstract
Prueba preclínica de terapias contra el cáncer se basa en modelos de xenoinjerto pertinentes que imitan las tendencias innatas del cáncer. Ventajas de los modelos estándar del flanco subcutánea incluyen facilidad procesal y la capacidad de respuesta sin la proyección de imagen invasiva y monitor la progresión del tumor. Tales modelos son a menudo inconsistentes en ensayos clínicos traslacionales y han limitado características biológicamente relevantes con baja tendencia a producir metástasis, ya que hay una falta de un microambiente nativo. En comparación, han demostrado modelos de xenoinjerto ortotópico en los sitios de tumor nativo imitar el microambiente del tumor y replicar las características de la enfermedad importante como diseminación metastásica distante. Estos modelos requieren a menudo tediosos procedimientos quirúrgicos con periodos prolongados de tiempo y recuperación anestésicas. Para hacer frente a esto, los investigadores del cáncer han utilizado recientemente técnicas de inyección guiada por ultrasonido para establecer modelos de xenoinjerto de cáncer para los experimentos preclínicos, que permite la creación rápida y confiable de modelos murinos dirigida de tejido. Visualización ecográfica también proporciona un método no invasivo para la evaluación longitudinal del engraftment del tumor y crecimiento. Aquí, describimos el método de inyección guiada por ultrasonido de las células de cáncer, utilizando la glándula suprarrenal para NB y cápsula renal sub es. Este acercamiento como mínimo invasor supera implantación tedioso cirugía abierta de las células cancerosas en ubicaciones específicas de tejido para el crecimiento y metástasis y disminuye en períodos de recuperación mórbida. Se describe la utilización de las líneas celulares establecidas y líneas celulares derivadas paciente de orthotopic inyectable. Kits comerciales prefabricados están disponibles para disociación de tumor y luciferasa el marcaje de las células. Inyección de la suspensión celular utilizando la dirección de la imagen proporciona una plataforma mínimamente invasiva y reproducible para la creación de modelos preclínicos. Este método se utiliza para crear modelos preclínicos confiables para otros cánceres tales como vejiga, hígado y ejemplificando su potencial sin explotar para numerosos modelos de cáncer de páncreas.
Introduction
Modelos de xenoinjerto animales son herramientas esenciales para los estudios preclínicos de nuevas terapias contra el cáncer. Xenoinjertos murinos estándar se basan en la implantación subcutánea del flanco de las células, proporcionando un sitio eficaz y accesible para monitorear el crecimiento del tumor. La desventaja de los modelos subcutáneas es su falta de características biológicas tumorales, que pueden limitar su potencial para metastatizar1. Tales limitaciones se superan mediante el uso de xenoinjertos de orthotopic en cual tumor las células se engrafted en sitios de tejido propio, proporciona un microambiente relevante potencial metastático2. Modelos de xenoinjerto de orthotopic mantienen características biológicas originales y modelos fiables para preclínica drogas discovery3,4. Las células de cáncer utilizadas para la implantación de tejido dirigida son las líneas celulares establecidas o derivados del paciente las células de tumores de pacientes. Xenoinjertos establecidos a partir de líneas celulares de cáncer pueden presentar alta divergencia genética del tumor primario en comparación con pacientes xenoinjertos derivadas5. Ante esto, el establecimiento de xenoinjertos ortotópicos derivados del paciente se ha convertido en el estándar preferido para las pruebas de nuevas terapias en descubrimiento de fármacos de cáncer.
En el neuroblastoma (NB) de cáncer pediátrico, modelos de xenoinjerto de orthotopic recapitulan la biología del tumor primario y desarrollan metástasis a sitios típicos de NB extendido6,7. NB se desarrolla en la glándula suprarrenal o a lo largo de la cadena simpática paravertebral. Los métodos más comunes de implantación ortotópica requieren procedimientos quirúrgicos trans abdominal abiertos. Tales métodos son a menudo tediosos, tienen alta morbilidad animal y períodos de recuperación complejos. Ecografía de alta resolución se ha utilizado recientemente para implantación dirigida de tejido de las células del tumor en el desarrollo de varios modelos murinos de cáncer investigación8,9. La técnica es fiable, reproducible, eficaz y seguro para el establecimiento del tumor metastático pertinentes xenoinjertos10,11.
El establecimiento de xenoinjertos de cáncer pediátrico por la implantación de aguja y localización de órgano blanco guiada por ultrasonido de líneas celulares y células tumorales derivados del paciente es demostrada11. La técnica fue utilizada por nota dirigida a la glándula suprarrenal murina. Sarcoma de Ewing (ES) es predominantemente un cáncer óseo, visto comúnmente en los huesos largos como el fémur y los huesos pélvicos12. Informes de casos han demostrado que para determinar si el crecimiento de un cáncer óseo predominante es factible en el tejido renal, fue elegida una localización capsular sub renal ortotópico implantación13. Implantación de renal sub capsular de la célula de las células tumorales se ha utilizado como un modelo prometedor para el estudio de las metástasis espontáneas ES14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Implantación guiada por ultrasonido de las células NB y ES es un método seguro y eficaz para establecer xenoinjertos murinos confiables para los estudios preclínicos en Biología del cáncer. Fundamental para el éxito de la guiada por ultrasonido implantación dirigida de tejido es la presencia y la disponibilidad de personal capacitado con experiencia en la localización anatómica del órgano de interés y en inyección estereotáctica de las células tumorales.
La disociación del teji…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo recibió apoyo de la Robert Wood Johnson Foundation/Amos Facultad desarrollo programa, Taubman Instituto de investigación médica y la sección de cirugía pediátrica, la Universidad de Michigan. Los autores desean agradecer a Kimber Converso-Baran y Dr. Marcus Jarboe la asistencia con los procedimientos de inyección de ultrasonido y la plataforma de proyección de imagen. Damos las gracias por su ayuda con los gráficos de la figura Paul Trombley. También agradecemos al Departamento de Radiología de la Universidad de Michigan para el uso del centro de imagen Molecular y el núcleo de la proyección de imagen del Tumor, que son apoyados en parte por integral cáncer Centro NIH, otorgar CA046592 P30. La Universidad de Michigan fisiología Phenotyping núcleo que es apoyado en parte por donaciones de fondos de los NIH (OD016502) y el Centro Cardiovascular de Frankel. Autenticación de línea celular se realizó en las instalaciones de IDEXX RADIL Bioresearch, Columbia, MO. Agradecemos a Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody y el programa de Oncología Tumor sólido de Mott. Nuestros pacientes y sus familias son reconocidas con gratitud por su inspiración, valor y apoyo continuo de nuestra investigación.
Materials
| Mice | |||
| NOD-SCID | Charles River | 394 | |
| NSG | The Jackson Laboratory | 5557 | |
| Cell Line | |||
| NB | |||
| IMR-32 | ATCC | CCL-127 | Established human neuroblastoma cell line |
| SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Established human neuroblastoma cell line |
| SK-N-Be2 | ATCC | CRL-2271 | Established human neuroblastoma cell line |
| ES | |||
| TC32 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A673 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| CHLA-25 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| A4573 | COGcell.ORG | Established human Ewing's Sarcoma cell line | |
| Cell Line media | |||
| RPMI | Life Technologies | 11875-093 | |
| Matrigel | BD BioSciences | 354234 | |
| Dissociation | |||
| Dissection Tools | KentScientific | INSMOUSEKIT | |
| Human Tumor Dissociation Kit | MACS Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| Luciferase Tagging | |||
| Lenti-GFP1 virus | University of Michigan, Vector Core | Luciferase Virus | |
| Steady Glo-Luciferase Assay Kit | Promega | E2510 | |
| Bioluminescence Imaging | |||
| Ivis Spectrum Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| D-Luciferin | Promega | E160X | |
| Anesthetic | |||
| Inhaled Isoflurane | Piramal Critical Care Inc | 66794-0017-25 | |
| Ultrasound Guided Injection | |||
| Vevo 2100 High Resolution Imaging | Vevo | 2100 | |
| Hamilton Syringes (27 gauge needle) | Hamilton | 80000 | |
| 22 Gauge Angiocatheter | BD Biosciences | 381423 | |
| Optical ointment | Major Pharmaceuticals | 301909 | |
| Nair | Church & Dwight Co | Hair Removal agent | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission gel | Parker | Ultrasound gel | |
| Histology | |||
| CD99 | DAKO | M3601 | Primary Antibody |
| Tyrosine Hydroxylase | Sigma-Aldrich | T2928 | Primary Antibody |
| Secondary HRP-Polymer antibody | Biocare | BRR4056KG | |
| Miscelleneous | |||
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| P1000 pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| P200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| P1000 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375E | |
| P200 pipette tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Portable pipette aid | Drummond | 4-000-101 | |
| digital animal Weighing Scale | KentScientific | SCL-1015 | |
| Calipers | Fisher Scientific | 06-664-16 | |
| 6well low attachment plates | Corning | 07-200-601 | |
| 10 cm Tissue Culture Treated Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
Riferimenti
- Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).
- Fidler, I. J., Hart, I. R. Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications. Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).
- Bibby, M. C. Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation. Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice. Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis. In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).
- Stewart, E., et al. Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft. Dev Biol. 407, 344-355 (2015).
- Jäger, W., et al. Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts. J. Vis. Exp. (84), e51123 (2014).
- Teitz, T., et al. Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment. PLoS ONE. 6 (4), e19133 (2011).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).
- Van Noord, R. A., et al. Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).
- Vormoor, B., et al. Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging. PLoS ONE. 9 (1), e85128 (2014).
- Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature. Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).
- Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor. Sarcoma. 2010, 174528 (2010).
- JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2018).
