Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche
Summary
Qui descriviamo un protocollo che permette l’analisi istologica e molecolare dei campioni della pelle dopo iniezione intradermica di Candida albicans . Questo protocollo mantiene l’integrità strutturale della pelle e permette per la localizzazione di cellule del sistema immunitario del tessuto-residente o recentemente reclutate come pure la distribuzione di agente patogeno.
Abstract
La pelle è un organo estremamente esteso del corpo e, a causa di questa grande superficie, è continuamente esposto a microrganismi. Danni alla pelle possono portare facilmente a infezioni nel derma che può, a sua volta, provoca la diffusione di agenti patogeni nel sangue. Comprendere come il sistema immunitario combatte le infezioni allo stadio molto precoce e come l’host può eliminare gli agenti patogeni è un passo importante per impostare la base per futuri interventi terapeutici. Qui descriviamo un modello di infezione dei albicans del Candida che può visualizzare i processi che si verificano precocemente durante un’infezione, anche quando l’agente patogeno ha superato la barriera epiteliale, come pure la risposta immunitaria da albicans del c. invasione. Abbiamo usato questo modello di infezione per eseguire analisi istologiche che mostrano le cellule immunitarie che infiltrano la pelle così come la presenza e la localizzazione dell’agente patogeno. I campioni raccolti dopo l’infezione possa essere elaborato per l’estrazione di RNA.
Introduction
Il corpo umano è ricoperto da un numero estremamente elevato di microrganismi. La superficie della pelle è l’habitat di quasi 1 milione di batteri per centimetro quadrato1. Questo numero, tuttavia, non riflette la varietà di microrganismi che colonizza la pelle. Oltre ai batteri, il corpo umano è colonizzato da numerose specie fungine, tra cui c. albicans, che è in grado di sopravvivere sia presso le mucose e la pelle livello2.
Negli ultimi anni, la percentuale di persone con diagnosticata di infezioni fungine è enormemente aumentato. Ciò è dovuto principalmente al maggior numero di persone immunocompromised, cioè, pazienti HIV-positivi e pazienti che sono passati attraverso la chemioterapia o farmaci immunosoppressori dopo trapianto3. In uno studio di sorveglianza effettuato negli Stati Uniti, Wisplinghoff et al hanno mostrato che il 9,5% delle infezioni nosocomiali flusso sanguigno erano causati da Candida specie4. Dovuto il caso aumentato di infezioni fungine e soprattutto per l’elevata percentuale di specie di Candida trovate durante infezioni del torrente sanguigno, capire come questo agente patogeno sfugge al controllo del sistema immunitario è estremamente importante.
C. albicans è un fungo dimorphic che cresce in diverse forme morfologiche come lievito, blastospores, pseudoife ed ife a seconda le condizioni ambientali5. Nella sua forma ifale, albicans del c. dimostra la sua capacità di invasività più alto e ha la capacità di penetrare l’ epitelio6.
Infezioni da c. albicans sono stati studiati utilizzando diversi approcci sperimentali. Il modello più comune di infezione è l’iniezione endovenosa di c. albicans lievito7. Tuttavia, questo modello non prendere in considerazione tutti i processi che accadono prima il fungo riesce a diffondersi nel flusso sanguigno. Un altro modello sfrutta la capacità dei albicans del c. di invadere l’epitelio. Questo metodo, noto anche come la carta vetrata modello8, è stato sviluppato da Gaspari, et al. , 1998,9e consiste nell’usare la carta vetrata per abradere la pelle, eliminando così lo strato corneo prima di applicare i albicans del c.. Questa procedura permette al fungo di penetrare l’epitelio, consentendo così l’analisi delle capacità invasiva di questo agente patogeno. Infine, altri modelli di infezioni per la gastrointestinale10 e respiratorie11 sono stati utilizzati in diversi studi.
La formazione di una ferita (come nel modello di carta vetrata) provoca l’attivazione di parecchie vie, compreso il reclutamento delle cellule immuni e attivazione, al fine di promuovere la guarigione di processo12. Questo può alterare o mascherare la risposta immunitaria in particolare contro l’agente patogeno, così conducendo alla confusione risultati.
Qui descriviamo un metodo di infezione della pelle che evita la formazione di ferita iniziale e l’induzione di un ambiente infiammatorio basale. Per mantenere la struttura epiteliale intatta, iniettiamo direttamente albicans del c. nella sua forma ifale nel derma profondo. Anche se una singola iniezione può suscitare lieve infiammazione, la quantità di infiammazione è limitata e limitata rispetto alla formazione di una ferita aperta come nel modello di carta vetrata. L’approccio che descriviamo qui permette lo studio della risposta immunitaria all’infezione fungina e diffusione, evitando l’ambiente infiammatoria eccessiva e preesistente causata da danni meccanici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto un metodo di c. albicans infezione per studiare il processo infiammatorio che è iniziato al fungina ingresso nel derma profondo.
Anche se la formazione di ascesso della pelle è un evento relativamente raro su c. albicans infezione15, iniezione del fungo direttamente nel derma profondo permette non solo lo studio della formazione di ascesso fungoso-driven, ma anche l’analisi di specifici immune cellule che partecipano per contene…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FG è supportato da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondazione Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ è supportato da NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton trovato, CCFA Senior Research Awards (412708), il Eleanor e il Miles Shore 50 ° anniversario Fellowship Program e la Fondazione Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
Riferimenti
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