Profundo dérmico inyección como un modelo de infección de la piel Candida albicans para el análisis histológico
Summary
Aquí se describe un protocolo que permite el análisis histológico y molecular de muestras de piel después de la inyección intradérmica de Candida albicans . Este protocolo mantiene la integridad estructural de la piel y permite la localización de las células inmunes residentes de tejido o recién contratadas así como la distribución de patógenos.
Abstract
La piel es un órgano extremadamente extendido del cuerpo y, debido a esta gran superficie, está continuamente expuesto a microorganismos. Daño de la piel puede fácilmente conducir a infecciones en la dermis que, a su vez, resulta en la diseminación de patógenos en el torrente sanguíneo. Entender cómo el sistema inmunológico combate infecciones en la etapa muy temprana y cómo el host puede eliminar los patógenos es un paso importante para establecer la base para futuras intervenciones terapéuticas. Aquí describimos un modelo de infección por Candida albicans que puede visualizar los procesos que ocurren durante una infección, incluso cuando el patógeno ha superado la barrera epitelial, así como la respuesta inmune provocada por el C. albicans invasión. Se utilizó este modelo de infección realizar análisis histológicos que muestran las células inmunes que infiltran la piel, así como la presencia y localización del patógeno. Las muestras recogieron después de la infección puede ser procesada para la extracción de RNA.
Introduction
El cuerpo humano se cubre con un número extremadamente alto de microorganismos. La superficie de la piel es el hábitat de casi 1 millón de bacterias por centímetro cuadrado1. Este número, sin embargo, no refleja la completa variedad de microorganismos que coloniza la piel. Además de las bacterias, el cuerpo humano es colonizado por muchas especies de hongos, incluyendo C. albicans, que es capaz de sobrevivir tanto en la mucosa y la piel nivel2.
En los últimos años, el porcentaje de personas diagnosticadas con infecciones micóticas ha aumentado enormemente. Esto es principalmente debido al mayor número de personas inmunocomprometidas, es decir, pacientes seropositivos y pacientes que han pasado por quimioterapia o fármacos inmunosupresores después del trasplante3. En un estudio de vigilancia realizado en los Estados Unidos, Wisplinghoff et al demostró que 9,5% de las infecciones de torrente sanguíneo nosocomial fueron causadas por Candida especies4. Debido a la mayor ocurrencia de infecciones por hongos y sobre todo por el elevado porcentaje de especies de Candida durante las infecciones del torrente sanguíneo , entender cómo este patógeno escapa del control del sistema inmunitario es extremadamente importante.
C. albicans es un hongo dimorfo que crece en diferentes formas morfológicas tales como levadura, pseudomicelio, pseudohyphae e hifas dependiendo de las condiciones ambientales5. En su forma hifal, C. albicans muestra su mayor capacidad de invasión y tiene la capacidad de penetrar el epitelio6.
Infecciones por C. albicans se han estudiado utilizando varias aproximaciones experimentales. El modelo más común de infección es la inyección intravenosa de C. albicans levadura7. Sin embargo, este modelo no toma en cuenta todos los procesos que suceden antes de que el hongo se las arregla para difundir al torrente sanguíneo. Otro modelo aprovecha la habilidad de C. albicans para invadir el epitelio. Este método, también conocido como el papel de la arena modelo8, fue desarrollado por Gaspari et en 19989y consiste en utilizar papel de lija para desgastar la piel, eliminando la capa córnea antes de aplicar la C. albicans. Este procedimiento permite que el hongo al penetrar en el epitelio, lo que permite el análisis de la capacidad invasiva de este patógeno. Por último, otros modelos de infecciones gastrointestinales10 y vías respiratorias11 se han utilizado en diferentes estudios.
La formación de una herida (como en el modelo de papel de lija) provoca la activación de varias vías, incluyendo el reclutamiento de células inmunes y activación, con el fin de promover la curación del proceso12. Esto puede alterar o enmascarar la respuesta inmune provocada específicamente contra el patógeno, lo que conduce a la confusión de resultados.
Aquí describimos un método de infección de la piel que evita la formación de la herida inicial y la inducción de un entorno inflamatorio basal. Para mantener la estructura epitelial intacta, inyectamos directamente C. albicans en su forma hifal en la dermis profunda. A pesar de que una sola inyección puede provocar inflamación leve, la cantidad de inflamación está limitada y restringida en comparación con la formación de una herida abierta como en el modelo de papel de lija. El método que se describe aquí permite el estudio de la respuesta inmunológica a la infección por hongos y la propagación evitando el ambiente inflamatorio excesivo y preexistente causado por daños mecánicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método de infección por C. albicans para estudiar el proceso inflamatorio que se inicia en la entrada de hongos en la dermis profunda.
Aunque la formación de abscesos de la piel es un acontecimiento relativamente raro sobre C. albicans infección15, inyección del hongo directamente en la dermis profunda permite no sólo el estudio de la formación del absceso basados en hongos, sino también el análisis de inmune específica c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
FG es apoyado por la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), la Fundación Cariplo (Grant 2014-0655) y Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ es apoyado por NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton Found, CCFA Senior Research Awards (412708), Eleanor y Miles Shore 50 aniversario programa de becas y la Fundación Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
Riferimenti
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