組織工学用植物組織の Decellularization の 2 つの方法
Summary
ここで私たちは、現在し、コントラストの 2 つのプロトコルを使用して植物組織を decellularize: 洗剤ベースのアプローチと洗剤無料アプローチ。両方の方法は、組織工学用の足場として利用することができます使用、植物組織の細胞外のマトリックスを残します。
Abstract
組織置換のための足場として使用されて自己、合成、動物由来の移植率の低い、貧しい生体適合性、コストなどの制限があります。植物組織に適して表面積が大きく、優れた水の輸送と保存などの足場として相互接続された気孔率、既存の血管ネットワーク、および機械の広い範囲を使用して、それら有利な特性を持っています。プロパティ。組織工学用植物 decellularization の 2 つの成功した方法は以下のとおりです。最初の方法は、洗剤お風呂使用の哺乳類ティッシュをクリアする以前に確立された方法に類似している携帯電話の問題を削除するに基づいています。2 番目の葉の血管系を分離し、葉と茎をクリアする塩浴と温水の漂白剤の使用を含むプロトコルから適応洗剤無料メソッドです。両方のメソッドは、同等の機械的性質と低細胞代謝の影響より良い自分の用途に合ったプロトコルを選択するユーザーをできるように足場を得られます。
Introduction
組織工学生体組織を作成する 1980 年代の代理および可能性のあるアドレス重要な臓器不足1。1 つの戦略は、足場を刺激し、行方不明の組織や臓器を再生する体をガイドに使用しています。高度な 3次元印刷を作り出した独特な物理的性質の足場などにアプローチを製造、達成可能な物理的な生物的特性の多様な範囲の足場を製造する能力がチャレンジ2,3。 また、機能血管ネットワークの不足は、これらの技術が限定されていました 3 次元組織を再生します。足場として脱動物と人間組織の使用が回避この問題4,5,6,7で支援します。ただし、高コスト、バッチ間の可変性および限られた可用性の広まった使用を制限可能性があります脱動物骨格の8。患者に潜在的な病気の感染やいくつかの哺乳類ティッシュの脱9に対する免疫学的反応の懸念もあります。
セルロース、植物および細菌のソースから派生は、再生医療で幅広い用途のためのバイオマテリアルを生成する広く使用されています。いくつかの例があります: 骨10、11、軟骨12,13,14と創傷治癒の15。足場を構成するセルロースの耐久性と耐性を哺乳類細胞によって分解されている付加的な利点があります。これは、哺乳類細胞はセルロース分子を分解に必要な酵素を生成しないためにです。比較では、足場はコラーゲンなどの細胞外マトリックスから高分子を使用して生産、16容易に分解され、長期的なアプリケーションには適していない場合があります。コラーゲンの足場は、化学架橋により安定化することができます。ただし、足場17の生体適合性に影響を与えるゲルビーズの固有の毒性のためのトレードオフがあります。逆に、セルロースには、哺乳類細胞18,19,20による酵素分解に不浸透ではないため長時間の注入のサイトで存在を維持する可能性があります。これは加水分解前処理の分解の率およびセルラーゼ21足場の共同配信をチューニングすることによって変更できます。植物由来セルロースの脱足場体内の生体適合性は、マウス22に行われた研究で実証されています。
進化の何百万年の何百も、植物はその構造と流体輸送と保存の効率を高めるための構成を洗練しています。工場血管は、小型船の場合、マレーの法23によると哺乳類の血管のように分岐することで油圧抵抗を最小限に抑えます。Decellularization 後、植物の相互接続された毛穴と血管の複雑なネットワークは維持されます。、すぐに利用できる異なる植物種の膨大な数を考慮した植物由来足場現在組織工学24,25の足場に影響を与える設計上の制限を克服するために可能性があります。例えば、Modulevskyらは脱アップル組織は皮下22マウスの背中に移植されたときに血管新生や細胞の移行が発生したことを示した。同様に、Gershlakらは、血管内皮細胞を脱葉24の血管内で成長するかもしれないことを示した。別の実験では、Gershlakらは心筋細胞が葉の表面上に成長させることができる、24を契約することができたことを示すことができるも。
植物には、複雑な組織を細胞からマクロ スケールで培った高度な製造技術とも達成するために困難であるにも含まれます。植物組織の複雑な階層設計、それらを彼らの成分26の合計よりも強く。植物は堅く、堅い茎等に至る種々 の機械的特性の茄多を持っている、27の葉よりフレキシブルで柔軟なものにします。葉は、サイズの面で種によって異なります、形状、破壊強度、血管新生、性、親水性の程度が異なるを運ぶことができます。全体的にみて、これらの植物のプロパティは、脱植物がティッシュ工学足場などのユニークで高機能な医療機器として使用できることを提案します。
このプロトコルは植物組織を decellularize に 2 つの方法に焦点を当てて、ようの葉し、茎、再生組織工学における足場として使用するため。最初の方法は DNA および哺乳類 decellularize し、組織6,22,25 を植物に広く使われている技術から適応されている携帯電話の問題を削除する風呂のシリーズを使用して洗剤ベースの技術 ,28,29,30。2 番目のメソッドは洗剤無料、一般に葉31の軟部組織を削除するために使用「白骨」プロトコルから適応。前の仕事を示したことは血管の周囲の軟部組織の31からの分離を促進漂白剤と炭酸水素ナトリウムの溶液に葉をぐつぐつ煮えます。この手法は、17回と 18th世紀、アルベルトゥスマグヌス セバ32とエドワード ・ パリッシュ33の仕事などで行う実験に引用できます。これらの実験は、葉や果物などの植物の問題を残すことのまわりの中心は長時間水に浸漬時間 (週か月) と当然のことながら朽ち果てるに柔らかい組織を許可します。ここで「白骨化」アプローチは、細胞残渣を削除する、かなり軟部組織構造を崩すことを避けるために低温培養時間が長くなるなど、穏やかな条件を使用する適応されます。ここに詳細な実験、3 つの植物のタイプを使用しました:イチジク オオバアサガラ、パキラアクアティカとフクギの種。DNA の定量化、機械テスト、および両手法による細胞の代謝活性に与える影響の結果を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、植物組織を decellularize に 2 つの方法を説明します。ここでは、提示される結果25先行研究の結果と相まって出すプロトコルが可能性があることをお勧めの広いスペクトルに適用される植物種と茎と葉の両方で実行できます。これらの手順は単純な特殊な機器は必要ないので植物 decellularization は、ほとんどの実験室で行うことが。それは decellularization 後、足場必要が…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
快くこのプロジェクトで使用される試料を供給するためオルブリッチ庭園のジョン ・ ワースに感謝したいと思います。この作品は、国民の中心、肺および血の協会で一部サポートされて (G.R.G.、R01HL115282)全米科学財団 (DGE1144804 J.R.G、G.R.G.)、ウィスコンシン大学外科教室と同窓会基金 (H.D.L.)。この作品は、環境保護庁 (星グラント号 83573701)、国立衛生研究所 (R01HL093282 01A1 と UH3TR000506)、全米科学財団 (IGERT DGE1144804) 部分で支えられましたまた。
Materials
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
| Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
| Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
| Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
| Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |
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