A11-positive β-amyloid Oligomer forberedelse og vurdering ved hjælp af Dot Blotting analyse

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan at forberede Aβ oligomerer fra en syntetisk peptid i vitro og evaluere relative mængder af Aβ oligomer af en prik blotting analyse.

Abstract

Β-amyloid (Aβ) er en hydrofobe peptid med en iboende tendens til at selv samle til aggregater. Blandt forskellige aggregater, Aβ oligomer er bredt accepteret som den førende nervegift i forløbet af Alzheimers sygdom (AD) og er anset for at være den afgørende begivenhed i patogenesen af annonce. Derfor Aβ oligomer hæmmere kan forhindre neurodegeneration og har potentiale til at blive udviklet som Sygdomsmodificerende behandlinger af annonce. Men forskellige dannelse protokoller af Aβ oligomer kan føre til oligomerer med forskellige karakteristika. Desuden er der ikke mange metoder til effektivt skærmen Aβ_1-42 oligomer hæmmere. En A11 antistof kan reagere med et undersæt af giftige Aβ_1-42 oligomer med anti-parallelle β-plade strukturer. I denne protokol beskriver vi, hvordan at forberede en A11-positive Aβ_1-42 oligomer-rige prøve fra en syntetisk Aβ_1-42 peptid i vitro og evaluere relative mængder af A11-positive Aβ_1-42 oligomer i prøver af en prik blotting analyse ved hjælp af A11 og Aβ_1-42-specifikke 6E10 antistoffer. Ved hjælp af denne protokol, kan hæmmere af A11-positive Aβ_1-42 oligomer også blive screenet fra semi-kvantitative eksperimentelle resultater.

Introduction

Alzheimers sygdom (AD) er en af de vigtigste neurodegenerative sygdomme hos ældre mennesker over hele verden¹. Det er almindeligt accepteret, at unormale sammenlægning af β-amyloid (Aβ) kan være den førende patologiske faktor af annonce. Aβ aggregater er de vigtigste komponenter i de senile plaques, en af de biologiske markører i hjernen hos AD patienter. Derudover producere Aβ aggregater, herunder oligomerer især potent neurotoksicitet, som kan være årsag til neuronal død som AD skrider frem. Derfor, hæmning af Aβ oligomer dannelse kan forhindre neurodegeneration, og Aβ oligomer hæmmere kan udvikles som Sygdomsmodificerende behandlinger af annonce. Mange undersøgelser har brugt en syntetisk Aβ peptid at danne oligomerer in vitro, udforske morfologier og strukturer af kunstige Aβ oligomerer og undersøge hæmmere af Aβ oligomer ved hjælp af in vitro- modeller^{2,3 , 4}. imidlertid forskellige in vitro- dannelsen protokoller af Aβ oligomer kunne føre til oligomer med forskellige morfologiske karakteristika, der kan forårsage de uforlignelige resultater blandt forskellige forskergrupper. Derfor er en standard dannelse protokol for Aβ oligomer bydende nødvendigt.

Indtil nu, er ikke mange metoder blevet rapporteret til direkte registrere Aβ oligomerer. Transmission elektroniske mikroskopi (TEM), ikke-denatureringen gelelektroforese, enzymmaerket assay (ELISA) og dot blotting analyse kan bruges til at undersøge beløb og/eller morfologi af Aβ oligomer in vitro-^{5, 6}. For eksempel morfologi og struktur af Aβ oligomer kan observeres i TEM. De relative mængder og molekylær størrelse af Aβ sammenlægninger kunne måles af ikke-denatureringen gelelektroforese. ELISA kan bruges til at bestemme Aβ oligomer i serum, plasma og uddrag af hjernevæv. Dot blotting analyse, en teknik, der anvendes til påvisning af, kan analysere og identificere proteiner, endelig anvendes til at evaluere den relative koncentration af Aβ oligomer i forskellige prøver ved hjælp af oligomer-specifikke og Aβ-specifikke antistoffer. Desuden tilbyder en prik blotting assay betydelige tidsbesparelser, som gelelektroforese og blotting procedurerne for geler ikke er påkrævet. Derfor, denne analyse bruges normalt til at skærmen potentielle Aβ oligomer hæmmere. Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive en relativt simpel, pålidelig og reproducerbar metode for at forberede en Aβ_1-42 oligomer-rige prøven, til at analysere mængden af Aβ_1-42 oligomer af dot blotting analyse, og at skærmen Aβ oligomer inhibitorer ved hjælp af semi-kvantitative eksperimentelle resultater.

Protocol

1. løsning forberedelse Bemærk: Se Tabel af materialer for reagens kilder. Forbered en 5% bovint serumalbumin (BSA) løsning ved at tilføje BSA. 5 g i 100 mL dobbeltdestilleret vand. Bland dem helt af vortexing dem. Gemme løsning ved 4 ° C i op til 1 måned. Forbered en anti-oligomer antistof A11 løsning (1:1, 000) ved at tilføje 10 µL antistof stamopløsning 10 ml 5% BSA løsning. Bland dem helt af vortexing dem. Gemme løsning ved 4 ° C i op til …

Representative Results

For at undersøge, om en Aβ1-42 monomer kan danne en Aβ1-42 oligomer efter tilberedning, blev TEM analyse anvendt. Ingen synlige aggregater blev observeret i HFIP-opløst Aβ1-42 monomer prøve (fig. 1A). Derudover hovedsageligt kugleformede aggregater med en diameter på omkring 10-80 nm blev observeret i Aβ1-42 prøve efter 48 h, rysten, tyder på, at Aβ1-42 danner oligomerer efter …

Discussion

I denne protokol, har vi rapporteret en metode til at forberede prøverne der indeholder Aβ_1-42 oligomer og analysere mængder af A11-positive Aβ_1-42 oligomer af en prik blotting analyse. Selv om vores metoder til forberedelse af Aβ_1-42 oligomer-rige prøver er ganske enkel, pålidelig og reproducerbar, er der stadig nogle punkter at blive bemærket. For det første der HFIP bruges til at opløse den syntetiske Aβ_1-42 peptid. En aggregeret Aβ_1-42 peptid kan adsk…

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi