A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

Summary

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.

Abstract

Β-amyloid (Aβ) is een hydrofobe peptide met een intrinsieke tendens u zelf samenvoegen tot aggregaten. Onder diverse aggregaten, Aβ oligomeren algemeen aanvaard wordt als de toonaangevende neurotoxine in de voortgang van de ziekte van Alzheimer (AD) en wordt beschouwd als de cruciale gebeurtenis in de pathogenese van AD. Daarom Aβ oligomeren remmers misschien voorkomen neurodegeneratie en hebben het potentieel om te worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. De vorming van de verschillende protocollen van Aβ oligomeren kunnen echter leiden tot oligomeren met verschillende kenmerken. Bovendien, er zijn niet vele methoden om effectief scherm Aβ_1-42 oligomeren remmers. Een antilichaam A11 kan reageren met een subset van giftige Aβ_1-42 oligomeren met anti-parallel β-sheet structuren. In dit protocol beschrijven we hoe te bereiden een A11-positieve Aβ_1-42 oligomeren-rijke monster uit een synthetische Aβ_1-42 peptide in vitro en evalueren van relatieve hoeveelheid A11-positieve Aβ_1-42 oligomeren in monsters met een dot bevlekken analyse met behulp van de A11 en Aβ_1-42-specifieke 6E10 antilichamen. Met behulp van dit protocol, kunnen remmers van A11-positieve Aβ_1-42 oligomeren ook worden afgeschermd van de van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.

Introduction

De ziekte van Alzheimer (AD) is een van de belangrijkste neurodegeneratieve ziekten van van oudere mensen wereldwijd¹. Het is algemeen aanvaard dat de abnormale aggregatie van β-amyloid (Aβ) de dominante pathologische factor van advertentie kan worden. Aβ aggregaten zijn de belangrijkste onderdelen van de seniele plaques, één van de biologische markers in de hersenen van patiënten van de advertentie. Bovendien produceren Aβ aggregaten, in het bijzonder, met inbegrip van oligomeren potente neurotoxiciteit, die mogelijk de oorzaak van de neuronale dood als AD vordert. Daarom, neurodegeneratie ertoe leiden dat de remming van de vorming van Aβ oligomeren en Aβ oligomeren remmers kunnen worden ontwikkeld als ziekte-aanpassen behandelingen van AD. Vele studies hebben gewend een synthetische Aβ peptide vormen oligomeren in vitro, morphologies en structuren van kunstmatige Aβ oligomeren verkennen en onderzoeken de inhibitors van Aβ oligomeren met behulp van in vitro modellen^{2,3 , 4}. echter verschillende in vitro vorming protocollen van Aβ oligomeren kunnen leiden tot oligomeren met verschillende morfologische kenmerken, die de onvergelijkbare resultaten onder de verschillende onderzoeksgroepen zou kunnen veroorzaken. Een standaard formatie-protocol voor Aβ oligomeren is daarom dringend noodzakelijk.

Tot nu toe niet veel methoden om direct detecteren Aβ oligomeren gemeld. Transmissie elektronische microscopie (TEM), niet-denaturering gelelektroforese enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en stip bevlekken analyse kunnen worden gebruikt om te onderzoeken de hoeveelheid en/of de morfologie van Aβ oligomeren in vitro^{5, 6}. bijvoorbeeld, de morfologie en de structuur van Aβ oligomeren kunnen worden waargenomen in TEM. De relatieve hoeveelheden en moleculaire grootte van Aβ aggregaties kunnen worden afgemeten aan niet-denaturering gelelektroforese. ELISA kan worden gebruikt om te bepalen van Aβ oligomeren in serum, plasma en extracten van hersenweefsel. Tot slot, dot bevlekken analyse, een techniek die wordt gebruikt voor het opsporen, analyseren en identificeren van eiwitten, kan worden gebruikt om de relatieve concentratie van Aβ oligomeren in verschillende monsters met behulp van oligomeren-specifieke en Aβ-specifieke antilichamen. Bovendien biedt een stip bevlekken assay aanzienlijke tijd te besparen, zoals de gelelektroforese van het en de Bevlekkende procedures voor gels niet nodig zijn. Deze bepaling is derhalve normaal scherm potentiële Aβ oligomeren remmers gebruikt. Het algemene doel van dit protocol is voor het beschrijven van een relatief eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare methode ter voorbereiding van een monster Aβ_1-42 oligomeren-rijk, voor het analyseren van de hoeveelheid Aβ_1-42 oligomeren met stip bevlekken analyse en scherm Aβ Oligomeer remmers met behulp van semi-kwantitatieve experimentele resultaten.

Protocol

1. oplossing voorbereiding Opmerking: Zie Tabel van materialen voor reagens bronnen. Bereid een 5% bovien serumalbumine (BSA) oplossing door 5 g BSA tot 100 mL van tweemaal gedestilleerd water toe te voegen. Meng ze volledig door vortexing hen. Bewaar de oplossing bij 4 ° C voor maximaal 1 maand. Bereid een anti-oligomeren antilichaam A11 oplossing (1:1, 000) door toevoeging van 10 µL van de stockoplossing van antilichaam aan 10 mL van de oplossing van 5%…

Representative Results

Om te onderzoeken of een Aβ1-42 monomeer een Aβ1-42 oligomeren na voorbereiding kan vormen, werd TEM analyse gebruikt. Geen zichtbare aggregaten werden waargenomen in de HFIP-ontbonden Aβ1-42 monomeer steekproef(Figuur 1). Bovendien voornamelijk bolvormige aggregaten met een diameter van rond 10-80 nm werden waargenomen in de steekproef Aβ1-42 na 48u schudden, suggereren dat Aβ1-42 o…

Discussion

In dit protocol hebben we een methode ter voorbereiding van de monsters met Aβ_1-42 oligomeren, en voor het analyseren van de hoeveelheid A11-positieve Aβ_1-42 oligomeren door een stip bevlekken analyse gemeld. Hoewel onze methoden voor de bereiding van Aβ_1-42 oligomeren-rijke monsters vrij eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn, zijn er nog enkele punten om opgemerkt te worden. In de eerste plaats wordt HFIP gebruikt voor het ontbinden van de synthetische Aβ_1-42 pept…

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi