A11-positive β-amyloid Oligomer तयारी आणि असेसमेंट प्रयोग डॉट सोख्ता विश्लेषण
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक सिंथेटिक पेप्टाइड से Aβ oligomers तैयार करने के लिए विट्रो में और एक डॉट सोख्ता विश्लेषण द्वारा Aβ oligomer के सापेक्ष मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए.
Abstract
β-amyloid (Aβ) स्वयं के लिए एक आंतरिक प्रवृत्ति के साथ एक hydrophobic पेप्टाइड है समुच्चय में इकट्ठा । विभिन्न समुच्चय के बीच, Aβ oligomer को अल्जाइमर रोग (ad) की प्रगति में प्रमुख neurotoxin के रूप में व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है और इसे विज्ञापन के रोगजनन में महत्वपूर्ण घटना माना जाता है । इसलिए, Aβ oligomer अवरोधकों neurodegeneration को रोकने और रोग-विज्ञापन के उपचार को संशोधित करने के रूप में विकसित होने की क्षमता हो सकता है । हालांकि, Aβ oligomer के विभिन्न गठन प्रोटोकॉल विभिन्न विशेषताओं के साथ oligomers करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, वहां नहीं है कई तरीकों को प्रभावी ढंग से स्क्रीन Aβ1-42 oligomer अवरोधकों । एक A11 एंटीबॉडी विरोधी समानांतर β-शीट संरचनाओं के साथ विषाक्त Aβ1-42 oligomer का एक सबसेट के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम इन विट्रो में एक सिंथेटिक Aβ1-42 पेप्टाइड से एक A11-positive Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना तैयार करने के लिए और एक डॉट द्वारा नमूनों में A11-धनात्मक Aβ1-42 oligomer की सापेक्ष मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए कैसे का वर्णन करें सोख्ता A11 और Aβ1-42-विशिष्ट 6E10 एंटीबॉडी का उपयोग कर विश्लेषण. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, A11 के अवरोधकों-सकारात्मक Aβ1-42 oligomer भी अर्द्ध मात्रात्मक प्रयोगात्मक परिणामों से दिखलाई जा सकता है ।
Introduction
अल्जाइमर रोग (AD) एक सबसे महत्वपूर्ण neurodegenerative रोगों दुनिया भर में बुजुर्ग लोगों को प्रभावित करने में से एक है1. यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि β-amyloid (Aβ) के असामान्य एकत्रीकरण विज्ञापन के प्रमुख रोग कारक हो सकता है । Aβ समुच्चय बूढ़ा सजीले टुकड़े, विज्ञापन रोगियों के दिमाग में जैविक मार्करों में से एक के मुख्य घटक हैं । इसके अलावा, Aβ समुच्चय, विशेष रूप से oligomers सहित, शक्तिशाली neurotoxicity, जो ंयूरॉन मौत का कारण हो सकता है के रूप में विज्ञापन की प्रगति का उत्पादन । इसलिए, Aβ oligomer गठन के निषेध neurodegeneration को रोकने सकता है, और Aβ oligomer अवरोधकों के रूप में विकसित किया जा सकता है रोग-विज्ञापन के उपचार को संशोधित करने । कई अध्ययनों से एक सिंथेटिक Aβ पेप्टाइड का इस्तेमाल किया है इन विट्रो मेंoligomers फार्म, morphologies और कृत्रिम Aβ oligomers के संरचनाओं का पता लगाने, और Aβ oligomer के अवरोधकों की जांच इन विट्रो मॉडल2,3 में , 4. हालांकि, इन विट्रो Aβ oligomer के गठन प्रोटोकॉल विभिन्न रूपात्मक विशेषताओं के साथ oligomer करने के लिए नेतृत्व कर सकता है, जो विभिन्न अनुसंधान समूहों के बीच अतुलनीय परिणाम हो सकता है. इसलिए, Aβ oligomer के लिए एक मानक गठन प्रोटोकॉल की तत्काल आवश्यकता है ।
अब तक, नहीं कई तरीकों को सीधे Aβ oligomers का पता लगाने के लिए सूचित किया गया है । ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (उनि), गैर-denaturing जेल ट्रो, एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा), और डॉट सोख्ता विश्लेषण की राशि और/या इन विट्रो5में Aβ oligomer की आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 6. उदाहरण के लिए, Aβ oligomer की आकृति विज्ञान और संरचना को उनि में देखा जा सकता है । Aβ एग्रीगेट के सापेक्ष मात्रा और आणविक आकार गैर-denaturing जेल ट्रो द्वारा मापा जा सकता है । एलिसा सीरम, प्लाज्मा में Aβ oligomer निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और मस्तिष्क के ऊतकों से निष्कर्षों । अंत में, डॉट सोख्ता विश्लेषण, एक तकनीक का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया, विश्लेषण, और प्रोटीन की पहचान, oligomer विशिष्ट और Aβ-विशिष्ट एंटीबॉडी की मदद से विभिन्न नमूनों में Aβ oligomer के सापेक्ष एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, एक डॉट सोख्ता परख महत्वपूर्ण समय बचत प्रदान करता है, जेल ट्रो और जैल के लिए सोख्ता प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है के रूप में । इसलिए, इस परख सामांय रूप से क्षमता Aβ oligomer अवरोधकों स्क्रीन किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य एक अपेक्षाकृत सरल, विश्वसनीय, और reproducible विधि का वर्णन करने के लिए एक Aβ1-42 oligomer-रिच नमूना तैयार करने के लिए, डॉट oligomer विश्लेषण द्वारा Aβ1-42 सोख्ता की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए, और Aβ oligomer स्क्रीन करने के लिए है अर्द्ध मात्रात्मक प्रयोगात्मक परिणामों का उपयोग कर अवरोधकों.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम Aβ1-42 oligomer युक्त नमूने तैयार करने के लिए एक विधि की सूचना दी है, और एक डॉट oligomer विश्लेषण द्वारा A11-सकारात्मक Aβ1-42 सोख्ता की मात्रा का विश्लेषण करने के लिए. हालांकि Aβ1-42 oligomer-रिच नमून?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (U1503223, ८१६७३४०७, २१४७५१३१), झेजियांग प्रांत (2016C37110), Ningbo अंतर्राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी के nonprofit प्रौद्योगिकी पर एप्लाइड अनुसंधान परियोजना से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया सहयोग परियोजना (2014D10019), जीवन विज्ञान और स्वास्थ्य के Ningbo नगर नवाचार टीम (2015C110026), Ningbo विज्ञान और तकनीक परियोजना आम धन (2017C50042) के लिए, ली डाक राशि यिप यिो चिन केनेथ ली समुद्री जैव भेषज विकास निधि, और Ningbo विश्वविद्यालय में वोंग Magna कोष के. सी.
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
Riferimenti
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