A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析
Summary
このプロトコルでは、体外で合成ペプチド a β オリゴマーを準備しドット解析をしみが付くことによって a β オリゴマーの相対量を評価する方法について説明します。
Abstract
Β アミロイド (a β) は集計に自己組み立てるに本質的な傾向と疎水性ペプチドです。各種骨材の中で a β オリゴマーはアルツハイマー病 (AD) の進行中の主要な神経毒として広く受け入れられている、AD の発症に重要なイベントであると見なされます。したがって、a β オリゴマー阻害剤が神経変性を防ぐため、疾患修飾として開発される可能性を秘めている AD の治療。しかし、a β オリゴマーの異なる形成プロトコルは、異なる特性を持つオリゴマーに可能性があります。さらに、効果的に画面 a β1-42オリゴマー阻害する多くの方法がないです。A11 抗体は逆平行 β シート構造を持つ有毒な a β1-42のオリゴマーのサブセットと反応できます。このプロトコルでは、合成 a β1-42ペプチド体外から A11 正 a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備し、ドットのしみが付くことによってサンプルの A11 正 a β1-42のオリゴマーの相対量を評価する方法について述べるA11 と a β1-42を用いた解析-特定 6E10 抗体。このプロトコルを使用して、A11 正 a β1-42のオリゴマーの阻害剤は、半定量的な実験結果から上映されることができます。
Introduction
アルツハイマー病 (AD) は、高齢者の世界的な1に影響を与える最も重要な神経変性疾患の一つです。Β アミロイド (a β) の異常凝集が広告の主要な病理要因かもしれないことが広く受け入れられます。A β の凝集体は、老人斑、AD 患者の脳の生物学的マーカーの 1 つの主要なコンポーネントです。さらに、特に、オリゴマーを含めて、a β の集計は、AD の進行性神経細胞死の原因かもしれない強力な毒性を作成します。したがって、a β オリゴマー形成の抑制、神経変性を妨げる可能性し、a β オリゴマー阻害剤は、疾患修飾として開発される可能性 AD の治療。多くの研究は、オリゴマー体外を形成、人工の a β オリゴマーの構造と形態を探検し、調査を使用して生体外モデル2,3 a β オリゴマーの阻害剤を合成 a β ペプチドを使用しています。,4します。 しかし、a β オリゴマー形成プロトコル別の in vitroの異なる研究グループ間で比類のない結果が生じる別の形態学的特性を持つオリゴマーに 。したがって、a β オリゴマーの形成の標準的なプロトコルが急務します。
今までは、a β オリゴマーが直接検出することがない多くの方法を報告されています。透過電子顕微鏡 (TEM)、非変性ゲル電気泳動法、酵素免疫測定法 (ELISA) と分析にしみが付く点は、量および/または a β オリゴマー体外5,の形態を検討する使用ことができます。6。 形態と a β オリゴマー構造を TEM で観察するたとえば、します。相対的な量、a β の集計の分子サイズは、非変性ゲル電気泳動法によって測定できます。Elisa 法は、血清、血漿、脳組織からの抽出物で a β オリゴマーを決定する使用できます。最後に、ドット解析技術で検出すると、しみが付くことを分析して、タンパク質の同定に使えるオリゴマーおよび a β に固有の抗体の助けを借りて、異なるサンプル a β オリゴマーの相対濃度を評価します。また、試金を吸い取りドット ゲル電気泳動およびゲルのあぶらとりのプロシージャは必要ないため大幅な時間節約を提供しています。したがって、この試金は通常、画面 a β オリゴマー阻害剤を使用します。このプロトコルの全体的な目標は、ブロッティング解析、ドット、画面 a β オリゴマー a β1-42のオリゴマーの量を分析するため、a β1-42オリゴマーの豊富なサンプルを準備する比較的単純な信頼性と再現性のあるメソッドを記述するのには半定量的実験結果を用いた阻害剤。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは a β1-42のオリゴマーを含む試料を準備する分析をしみが付くことのドットで A11 正 a β1-42のオリゴマーの量を分析する方法を報告しています。A β1-42オリゴマーの豊富なサンプルの準備のための私たちの方法はかなりシンプルで、信頼性と再現性のある、まだ気づかれるべきいくつかのポイントがあります。まず、HFIP、合成 a β1-42ペプチド…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国家自然科学基金、中国の (U1503223、81673407、21475131)、浙江省の非営利技術 (2016 C 37110)、寧波国際科学技術に関する応用研究プロジェクトからの補助金によって支えられました。協力プロジェクト (2014 D 10019)、生命科学と健康 (2015 C 110026)、寧波科学技術プロジェクト共通の富 (2017 C 50042) オフイオチューカンあご・ ケネス ・李海洋バイオ医薬品開発基金李 Dak 合計イップ ・寧波市革新チーム・寧波大学 k. c. ウォン マグナ基金。
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
Riferimenti
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochimica. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer’s A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
