Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi

Summary

Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.

Abstract

Β-amiloide (Aβ) è un peptide idrofobo con un’intrinseca tendenza ad auto-assemblarsi in aggregati. Tra i vari aggregati, oligomero Aβ è ampiamente accettata come la neurotossina leader nel progresso della malattia di Alzheimer (AD) ed è considerato l’evento cruciale nella patogenesi dell’annuncio. Di conseguenza, Aβ oligomero inibitori potrebbero impedire la neurodegenerazione e hanno il potenziale per essere sviluppato come modificante la malattia trattamenti dell’annuncio. Tuttavia, i protocolli di diversa formazione di oligomeri Aβ potrebbero portare a oligomeri con caratteristiche diverse. Inoltre, non ci sono molti metodi per efficacemente gli inibitori di oligomero del_1-42 di schermo Aβ. Un anticorpo A11 può reagire con un sottoinsieme di tossico oligomero di Aβ_1-42 con strutture di β-foglio anti-parallelo. In questo protocollo, si descrive come preparare un campione di oligomero-ricco A11-positivi Aβ_1-42 da un sintetico Aβ_1-42 del peptide in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero di_1-42 di Aβ A11-positivi in campioni tamponando un puntino analisi usando A11 e Aβ_1-42-6E10 specifici anticorpi. Usando questo protocollo, inibitori dell’oligomero di A11-positivi Aβ_1-42 possono essere selezionati anche da risultati sperimentali semi-quantitativa.

Introduction

Morbo di Alzheimer (annuncio) è una delle più importanti malattie neurodegenerative che colpisce le persone anziane nel mondo¹. È ampiamente accettato che l’aggregazione anormale di β-amiloide (Aβ) può essere il fattore patologico principale dell’annuncio. Aggregati Aβ sono i componenti principali delle placche senili, uno dei marcatori biologici nei cervelli dei pazienti dell’annuncio. Inoltre, gli aggregati Aβ, oligomeri in particolare, producono neurotossicità potente, che potrebbe essere la causa della morte di un neurone come progredisce AD. Di conseguenza, l’inibizione della formazione di oligomeri Aβ potrebbe impedire la neurodegenerazione e inibitori oligomero Aβ potrebbero essere sviluppati come modificante la malattia trattamenti dell’annuncio. Molti studi hanno utilizzato un peptide Aβ sintetico per formare oligomeri in vitro, esplorare morfologie e strutture degli oligomeri Aβ artificiali e indagare gli inibitori dell’oligomero Aβ utilizzando in vitro modelli^{2,3 , 4}. Tuttavia, protocolli di formazione diversi in vitro dell’oligomero Aβ potrebbero portare a oligomero con differenti caratteristiche morfologiche, che potrebbe causare i risultati incomparabili tra diversi gruppi di ricerca. Di conseguenza, un protocollo di formazione standard per oligomero Aβ è urgentemente necessaria.

Fino ad ora, non ci sono molti metodi sono stati segnalati per rilevare direttamente oligomeri Aβ. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM), gel elettroforesi non-denaturante, analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) e dot blotting analisi può essere utilizzati per esaminare la quantità e/o la morfologia di Aβ oligomero in vitro^{5, 6}. ad esempio, la morfologia e la struttura dell’oligomero Aβ può essere osservati nel TEM. La quantità relativa e dimensioni molecolari delle aggregazioni di Aβ può essere misurate mediante elettroforesi non-denaturante. ELISA potrebbe essere utilizzata per determinare oligomero Aβ in siero, plasma ed estratti dal tessuto cerebrale. Infine, dot blotting analisi, una tecnica utilizzata per la rilevazione, analisi e identificazione di proteine, potrebbe essere utilizzato per valutare la concentrazione relativa di oligomero Aβ in diversi campioni con l’aiuto di anticorpi Aβ-specifiche e oligomero. Inoltre, un dot blotting analisi offre notevole risparmio di tempo, come l’elettroforesi del gel e le procedure macchiante per gel non sono necessari. Pertanto, questa analisi è usata normalmente per potenziali inibitori di oligomero Aβ di schermo. L’obiettivo generale del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice, affidabile e riproducibile per preparare un campione Aβ_1-42 oligomero-ricco, di analizzare la quantità di oligomero Aβ_1-42 da dot blotting analisi e oligomero Aβ schermo inibitori utilizzando semi-quantitativa di risultati sperimentali.

Protocol

1. soluzione preparazione Nota: Vedere Tabella materiali per le origini di reagente. Preparare una soluzione di 5% albumina di siero bovino (BSA) con l’aggiunta di 5 g di BSA per 100 mL di acqua bidistillata. Mescolare nel Vortex completamente loro. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese. Preparare una soluzione di A11 dell’anticorpo anti-oligomero (1:1, 000) aggiungendo 10 µ l di soluzione madre di anticorpo a 10 mL di soluzione di BSA al 5%. Mescola…

Representative Results

Per studiare se un monomero Aβ1-42 può formare un oligomero Aβ1-42 dopo la preparazione, analisi TEM è stata usata. Non aggregati visibili sono stati osservati nel campione HFIP-dissolta Aβ1-42 monomero (Figura 1A). Inoltre, principalmente globulari aggregati con un diametro di circa 10-80 nm sono stati osservati nel campione Aβ1-42 dopo 48 h di agitazione, suggerendo che Aβ1-42 fo…

Discussion

In questo protocollo, abbiamo segnalato un metodo per preparare campioni contenenti oligomero Aβ_1-42 e per analizzare la quantità di oligomero di A11-positivi Aβ_1-42 da un punto di analisi macchiante. Anche se i nostri metodi per la preparazione di campioni Aβ_1-42 oligomero-ricchi sono abbastanza semplici, affidabili e riproducibili, ci sono ancora alcuni punti per essere notato. In primo luogo, HFIP viene utilizzato per sciogliere sintetico peptide Aβ_1-42 . Un aggregato p…

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)	Abcam	GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)	Cell Signalling Technology	2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)	Millipore	AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)	Beyotime	A0208
Aβ1-42	GL Biochem	52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol	Aladdin	I1523078
Curcumin	Sigma	C1386
Albumin Bovine V	Solarbio	A8020
Sodium chloride	Sangon Biotech	D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate	SCR	30166428
TRIS	Solarbio	T8060
Glycine	Solarbio	G8200
Dimethyl sulfoxide	Solarbio	D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker	Beyotime	P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE	Genshare	JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane	Pall Corporation	T50189
Methanol	SCR	10014118
Ethanol	SCR	10009218
Super low range protein Marker	Solarbio	PR1300
Transfer Membranes	Immobilon-PSQ	ISEQ00010
BeyoECL Star	Beyotime	P0018A
Commassie Blue Fast staining solution	Beyotime	P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system	Tanon	Tanon 5200
Image J	National Institutes of Health
Image processing software	Adobe	Photoshop CS6
Magnetic agitator	Shanghai Huxi