كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد حجم المسام في المبيضين مثقف للفئران الصغار دون تقطيع المسلسل. استخدام الجهاز كاملة الفلورة والأنسجة المقاصة، تمزيقها المادية يتم استبداله بتقطيع الضوئية. هذا الأسلوب من إعداد العينة والتصور يحافظ على سلامة الجهاز ويسهل الآلي التقدير الكمي للخلايا المحددة.
Abstract
البحوث في مجال البيولوجيا الإنجابية الثدييات غالباً ما ينطوي على تقييم الصحة العامة المبايض والخصيتين. على وجه التحديد، في الإناث، وغالباً ما يتم تقييم اللياقة البدنية المبيض بتصور والتحديد الكمي للمسام وبويضات. نظراً لأن المبيض أنسجة ثلاثية الأبعاد معتمة، النهج التقليدية تتطلب مشقة تشريح الأنسجة إلى مقاطع المسلسل العديد من أجل تصور خلايا في جميع أنحاء الجهاز كامل. وعلاوة على ذلك، لأنه عادة ما يستتبع القياس الكمي بهذا الأسلوب سجل مجموعة فرعية فقط من أقسام مفصولة بقطر تقريبي البويضات، عرضه لعدم دقتها. هنا، هو وصف بروتوكول يستخدم بدلاً من ذلك إزالة الأنسجة الجهاز كله وتلطيخ الفلورة من المبايض الماوس وضع تصور للمسام وبويضات. ومقارنة بالأساليب التقليدية، هذا البروتوكول مفيد لتصور خلايا داخل المبيض لأسباب عديدة: 1) المبيض لا تزال سليمة في جميع أنحاء عينة التحضير والتجهيز؛ 2) يمكن فحص المبايض صغيرة، وصعبة للقسم، بسهولة؛ 3) يتحقق القياس الكمي الخلوية أكثر سهولة ودقة؛ و 4) الجهاز كله تصويرها.
Introduction
من أجل دراسة تكوين الخلوية والسمات المورفولوجية المبايض الثدييات، العلماء غالباً ما تعتمد على التجارب في فيفو متبوعاً بتلوين إيمونوهيستولوجيكال المبايض البارافين المضمنة. أكثر مؤخرا رغم ذلك، ثقافة الجهاز المبيض كله قد ثبت أن بديل فعال لدراسة وظيفة المبيض1،2،،من34 لأن هذه التقنية يمكن أن يقترن بالتصور أفضل و أدوات القياس الكمي. تقليديا، تحليلاً مورفولوجيا المبيض يعتمد على إعادة بناء هيكل المبيض ثلاثي الأبعاد من مقاطع المسلسل البارافين مضمن، ولكن، بالإضافة إلى كونها شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، متسلسل تقطيع الأنسجة البارافين مضمن لا ضمان إعادة البناء السليم للجهاز، وكثيراً ما فقدت أقسام أو أمر بسوء في العملية.
بالإضافة إلى التحديات التقنية المرتبطة بتقطيع المسلسل، وهناك أيضا اختلافات في الأساليب المستخدمة بشكل روتيني لتقدير أرقام جريب كل المبيض5،6. تباين المنهجية المستخدمة حاليا ويضعف التحليل التلوي لاحتياطي المبيض عبر الدراسات5،7. على سبيل المثال، يمكن أن تختلف أرقام جريب من المقالات والبحوث المختلفة بالوقت أو أكثر بين الإعمار إنمائية مماثلة ضمن سلالة معينة6. هذه الاختلافات الكبيرة في التحديد الكمي جريب المبلغ عنها يمكن أن يؤدي إلى الارتباك وعرقلت إجراء مقارنات عبر الدراسة. تجريبيا، يؤديها النهج التقليدية لتحديد مقدار جريب من مقاطع المسلسل العد المسام عدد محدد سلفا من المقاطع (مثلاً كل الخامسة، العاشرة، أو قسم آخر). ينشأ تقلب في تهم المسام باستخدام هذا النهج ليس فقط من التواتر في المقاطع التي يتم عدها، بل أيضا من الاختلافات في سمك الفرع، والخبرة التقنية في توليد مقاطع المسلسل5،6. بالإضافة إلى قابليته، عيب آخر لتقطيع الأنسجة التقليدية أن تقطيع المبايض صغيرة من صغار الحيوانات تنطوي على تحديات خاصة وتعتمد اعتماداً كبيرا على اتجاه الأنسجة8.
البروتوكول أدناه يصف أسلوب1 ثقافة مبيض تستخدم بشكل روتيني ولكن يحسن إلى حد كبير على التقدير الكمي جريب التقليدية عن طريق استبدال تمزيقها المادية مع أنسجة تطهير وتمزيقها الضوئية باستخدام مجهر [كنفوكل]8 ،9. مسح استخدام الغمر الأنسجة (بدون الحاجة لنضح transcranial أو التفريد) في اليوريا والسوربيتول-يستند إلى نظام الحل (مثلاً، ScaleS(0)10) ثبت متوافق مع إيمونوستينينج ويسمح للحد من مسح وقت دون المساس بعمق للتصوير. أساليب أخرى تم الإبلاغ عنها (مثلاً، ScaleA2،من810، سيدب11، كليارت12و ClearT212) أما أكثر تستغرق وقتاً طويلاً أو عدم السماح بالدقة البصرية متعمقة للعينة. تقطيع الضوئية مفيد لأنه أقل كثيفة العمالة ويحتفظ الجهاز هيكل ثلاثي الأبعاد7،8. فائدة أخرى من هذا النهج هو أن إعداد العينات التي لا تتطلب الكواشف باهظة التكلفة لإزالة الأنسجة، ويمكن أن تجري بسهولة نسبية.
على وجه التحديد، البروتوكول وصف قد الأمثل المبايض الماوس المستزرعة في يوم الولادة خمسة لكن أجريت على المبايض بدءاً من يوم الولادة 0-10. الأسلوب يجعل استخدام نظام الثقافة المبيض الذي تولي الأنسجة بالطبع للغشاء الذي كان هو مثقف، تسهيل التعامل مع الجهاز والتلاعب. يمكن استخدام نظام الثقافة ووصف للحفاظ على اكسبلانتيد المبايض لمدة تصل إلى 10 أيام وتقييم ظروف تجريبية مختلفة كيف قد تتداخل مع بقاء البويضات13. تتم باستخدام الصورة غير التجارية تجهيز الحزمة فيجي-إيماجيج14 إجراء التقدير الكمي ووصف ويمكن أن تجري في معظم أجهزة الكمبيوتر الشخصية. وعلاوة على ذلك، الصور المستخدمة للقياس الكمي يمكن أن يتاح على نطاق واسع للمجتمع العلمي، مما يسمح للتحليل التلوي مستقبلا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويتطلب دراسة استنساخ الثدييات استخدام والتحديد الكمي للخلايا المتخصصة غير قابلة بشكل روتيني لزراعة الخلايا. السابقين فيفو ثقافة أنظمة غير فعالة في الحفاظ على المبيض والمسام صلاحية1،15. خلال الثقافة المبيض، الأنسجة يتطلب مساحة أكبر لتبادل المواد الغذ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ريبيكا وليامز وجوانا ديلا كروز من “تصوير BRC كورنيل” وأندرو ريكناجيل للاقتراحات المفيدة والمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل إلى المعاهد الوطنية للصحة منحة S10-OD018516 (“مرفق” كورنيل للتصوير)، و T32HD057854 إلى J.C.B. و R01-GM45415 إلى J.C.S.
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
Riferimenti
- O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts – not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetica. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Biologia dello sviluppo. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, (2017).
