복잡 한 인간의 질병에 기여 하는 유전 이체의 소설 메커니즘을 식별 수 있습니다. 여기, 후보 유전자 또는 유전자 통로 분석 낮은 비용 범위를 극대화 하 고 코 호트 기반 연구 의무가 멀티플렉스 유전형 접근 방식을 설명 합니다.
복잡 한 질병 종종 질병 민감성에 기여 하는 여러 일반적인 유전자 변종에 의해 underpinned 아 르. 여기, 우리는 질량 분석, 있는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 사용 하 여 임상 동료에 있는 유전자 통로 협회 조사 비용 효율적인 태그 단일 염기 다형성 (SNP) 접근을 설명 합니다. 우리는 예를 들어 음식 알레르기 후보 소재 시 Interleukin13 (IL13)를 조사합니다. 이 메서드는 효율적으로 지역 내의 공유 결합 불균형 (LD)을 이용 하 여 범위를 최대화 합니다. 선택 된 LD Snp는 다음에 설계 다중화 분석 결과 40 다른 Snp 동시에 분석할 수 있도록 비용 효율성을 향상. 연쇄 반응 (PCR) 단일 뉴클레오티드 확장명 대상 loci를 증폭 하는 사용 되 고 있는 amplicons 다음 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 flight(MALDI-TOF) 질량 분석을 사용 하 여 측정 됩니다. 원시 출력 소프트웨어, 엄격한 품질 관리 정 및 컷-오프를 사용 하 여 호출 하는 유전자 형을 분석 하 고 높은 확률 genotypes 되 고 데이터 분석에 대 한 출력.
인간의 복잡 한 질병에 유전 이체 질병 민감성에 기여 하 고 이러한 변형 측정 이해 병 인, 고 위험 환자 그룹, 및 치료 조치를 식별 하는 데 유용 있을 수 있습니다. 실제로, 정밀 의학의 약속은 환자 서브 그룹1을 식별 하는 게놈 정보를 이용 하 여 의존 합니다. 불행히도, 공간 내에 복잡 한 질병 생물학, 어디 질병 고기 상당한 유전이 성분, 낮은 penetrance, 가변 표현력에 의해 underpinned 아 르, 일대 소설 식별을 게놈 넓은 접근에 대 한 요구 사항 크기 후보 들은 엄청나게 큰2입니다. 또한, 대상된 후보 유전자 접근 질병 병 인3특정 유전자/경로 대 한 선험적 가설으로 시작합니다. 경로 분석 도구 일반적으로 탐구 될 수많은 후보 경로 생성 한 확인된 대상 loci의 이상 조사 하는 데 사용 됩니다. 여기 다중화 유전형 접근 인간의 코 호트 연구4에 적합 한 분석 결과 함께 Snp의 수백 수만의 조사에 대 한 수 있도록 설명 합니다. 이 방식은 상대적으로 높은 통해-넣어, 수백 수 소설 발견 연구에 대 한 genotyped DNA 샘플의 수천 및 특정 경로 조사를 허용 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 유용 식별 위험 대립 유전자 및 임상 특성의 그들의 협회에 대 한 상대적으로 신속 하 고 저렴 한 방식으로 합니다. 이 플랫폼은 미생물 감염7 및 인간 유 두 종 바이러스8등에 대 한 검사 및 진단 목적5,6, 최근, 매우 유리한 되었습니다.
이 프로토콜은 조사, 즉유전자의 세트의 선택과 시작., 일반적으로 문학 검색, 또는 질병 과정;에 참여에 대 한 선험적 가설을 통해 결정 대상 지역 또는 아마도 검색 게놈 넓은 협회 (GWA) 연구의 주요한 연결으로 복제에 대 한 선택. 유전자 집합에서 연구원 태그 Snp의 세련 된 목록을 선택 합니다. 즉, 결합 불균형 (LD), 또는 지역에서 변종 사이 상호 관계는 haplotype 이라고 높은 LD에 Snp의 그룹에 대 한 대표 ‘태그 SNP’ 식별 하 데 사용 됩니다. 지역의 높은 LD는 유전형 한 SNP는 haplotype에서 모든 Snp에 변화를 표현 하기 위해 충분 한 Snp는 함께 상속 자주는 것을 의미 합니다. 또는, 많은 지역, 예를 들어에서 Snp의 최종 목록에 다음과 같은 경우., GWA 연구에 대 한 복제,이 프로세스 해야 하지. 멀티플렉스 유전형 분석 결과 다음 설계 되어야 합니다 이러한 목표 주위는 증폭 뇌관 연장 뇌관의 질량 다른의 고 해석할 생산 제품 질량 스펙트럼. 이 매개 변수는 멀티플렉스 유전형 분석 결과 디자인 도구에 의해 쉽게 구현 됩니다. 이 디자인에서 앞으로 역 뇌관 관심의 마커를 대상 하는 SNP를 포함 하는 시퀀스를 증폭에 사용 됩니다. 확장 뇌관은 Snp에 직접 인접 연결 하 고 단일, 대량 수정, ‘터미네이터’ 기반은 SNP에 보완을 추가 됩니다. 터미네이터 자료 추가 DNA의 확장을 방지합니다. 기지의 대량 수정 파편을 질량 분석에 의해 감지 되는 단일 자료에 의해 다른 수 있습니다. 유전형 화학을 포함 하는 접시 측정 질량 분석 플랫폼에 대 한 칩에 적용 됩니다. 시스템에 의해 감지 원시 유전형 호출에 적절 한 품질 제어를 적용 한 후 데이터는 수출 고 연관 질병 고기에 대 한 테스트에 통계 분석을 위해 사용 될 수 있습니다.
여기, 다중화 된 유전형 질량 분석을 사용 하 여 방법을 설명 합니다. 대표 결과 MALDI TOF 질량 분석4 분석 결과 화학 재료의 표13에 나열와 결합 하는 PCR를 사용 하 여 생성 되었다. 이 플랫폼으로 실험실에서 총 1,255 개인 40 h 이내 9 Snp에 대 한 11,295 genotypes 생성 했습니다.
우리는 생성 SNP 후보 유전자 IL13 발견 임상 코 호트 ?…
The authors have nothing to disclose.
저자 아무 승인 있다.
Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
Micropipettes | single and 8-channel | ||
Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
Plate rotator | |||
MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |