Contaminazione durante il sequenziamento genomico di organismi microscopici rimane un grande problema. Qui, vi mostriamo un metodo per sequenziare il genoma di un Tardigrada da un singolo esemplare con appena 50 pg di DNA genomic senza amplificazione intero genoma per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.
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Articolo metodologico
Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade
In questo articolo
Sommario
Abstract
I tardigradi sono animali microscopici che entri in uno stato di ametabola anhydrobiosis chiamato fronte di essiccazione e può tornare al loro stato originale quando l'acqua è fornita. Il sequenziamento genomico di microscopici animali come i tardigradi rischi la contaminazione batterica che a volte porta a interpretazioni errate, ad esempio, per quanto riguarda il limite di trasferimento genico orizzontale in questi animali. Qui, forniamo un metodo di input ultrabasso per sequenziare il genoma di Tardigrada, Hypsibius dujardini, da un singolo esemplare. Impiegando rigorosa esclusione di lavaggio e contaminante insieme ad un'efficiente estrazione del 50 ~ 200 pg DNA genomico da un singolo individuo, abbiamo costruito una biblioteca sequenziata con uno strumento di sequenziamento del DNA. Queste librerie sono state altamente riproducibile e imparziale, e un'analisi informatica della sequenza si legge con altri genomi di H. dujardini ha mostrato una quantità minima di contaminazione. Questo metodo può essere applicato per i tardigradi saggiati che potrebbero non essere sequenziati utilizzando metodi precedenti.
Introduzione
I tardigradi sono animali microscopici che possono entrare in uno stato di ametabola chiamato anhydrobiosis quando essiccazione di fronte. Recuperano dall'assorbimento di acqua1,2. Nello stato ametabola, i tardigradi sono in grado di tollerare i vari ambienti estremi, quali temperature estreme pressioni e3 4,5, un alto dosaggio di luce ultravioletta6, raggi x e raggi gamma 7 , 8e9di spazio cosmico. Dati genomici sono un fon....
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Protocollo
1. preparazione
- Preparare il gel di agarosio al 2% utilizzando acqua distillata (DW) come il solvente contenuto in una piastra di coltura plastica 90 mm e 10 mL di una cocktail con DW penicillina/streptomicina 1%. Il gel può essere conservato per 2-3 settimane in un incubatore a 18 ° C.
Nota: Evitare qualsiasi deposito del gel sotto i 10 ° C, per la bassa temperatura si ridurrà il gel di agarosio, risultante in un minuscolo gap tra il gel e la parete del piatto di cultura in cui i tardigradi possono essere intrappolati.
2. campione preparazione ed esclusione delle sostanze contaminanti
- Raccogliere un singolo Tar....
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Risultati
Esclusione delle sostanze contaminanti:
Questo protocollo prevede un lavaggio accurato del Tardigrada e una sterilizzazione con antibiotici cura per minimizzare la contaminazione. Implica anche un processo di verifica visivo per assicurare la completezza di questi processi. Un'immagine del microscopio fatta durante la convalida (punto 2.4 del protocollo) è illustrata nella Figura 2........
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Discussione
Contaminazione batterica rappresenta una minaccia per il sequenziamento genomico di organismi microscopici. Mentre gli studi precedenti sul sequenziamento del genoma tardigrade hanno filtrato contaminazione utilizzando metodi informatica vasto12,20, abbiamo sequenziato il genoma da un singolo individuo per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni. Poiché un singolo Tardigrada contiene circa il 50-200 pg di genomic DNA16 ed è racchius.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Nozomi Abe, Yuki Takai e Nahoko Ishii per il loro supporto tecnico nel sequenziamento genomico. Quest'opera è stata sostenuta di sovvenzione per la società del Giappone per la promozione della scienza (JSPS) Research Fellow, sovvenzione dai KAKENHI per giovani scienziati (No.22681029) e KAKENHI sovvenzione per la ricerca scientifica (B), no. 17 H 03620 da JSP, da un Sovvenzione per progetti di ricerca di scienza base da The Sumitomo Foundation (No.140340) e in parte da fondi di ricerca dal governo della Prefettura di Yamagata e città di Tsuruoka, Giappone. Chlorella vulgaris utilizzata per alimentare i tardigradi è stato fornito per gen....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio SZ61 | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillina Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 Sistema | Keyence | ||
| 0,2mL Tubo con rivestimento in silicone | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Kit Microprep | ZYMO Research | D3021 | L'uso di questo kit è assolutamente fondamentale; vedere il passaggio 3.1 |
| Microprovetta da 1,5 mL | greiner bio-one | 616-201 | Vedere 4.1.1 |
| Microcentrifuga refrigerata ad alta velocità | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | ||
| Kit ThruPLEX DNA-Seq | Rubicon Genomics CAT | . NO. R400406 | L'uso di questo kit è assolutamente fondamentale; vedere il passaggio 4.2 |
| Termociclatore | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| Reagente AMPure XP | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Etanolo | Wako | 054-027335 | |
| EB tampone | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagenti | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Tampone/Reagente | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 ciclo v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| Sequenziatore MiSeq | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
Riferimenti
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P.
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Ristampe e permessi
