أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج
Summary
نقدم هنا، أورجانوتيبيك استزراع البروتوكول لتنمو الأجهزة الدجاج الجنينية في المختبر. باستخدام هذا الأسلوب، تنمية الأنسجة الجنينية الدجاج يمكن دراستها، مع الحفاظ على درجة عالية من السيطرة على البيئة الثقافة.
Abstract
الدجاج الجنينية يستخدم عادة ككائن نموذج موثوق بها للتنمية الفقاريات. إمكانية الوصول وحضانة قصيرة الفترة يجعلها مثالية للتجريب. حاليا، تجري دراسة هذه المسارات الإنمائية في الجنين الدجاج بتطبيق مثبطات والمخدرات في مواقع محلية وتركيزات منخفضة باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب. استزراع الأنسجة في المختبر هو أسلوب الذي يتيح دراسة الأنسجة فصلها عن الكائن الحي المضيف، بينما في الوقت نفسه تجاوز العديد من القيود المادية الحالية عند العمل مع الأجنة كله، مثل قابلية الأجنة إلى جرعات عالية من المواد الكيميائية يمكن أن تكون مميتة. نقدم هنا، أورجانوتيبيك استزراع البروتوكول لاستزراع الدجاج الجنينية نصف الرأس في المختبر، مما يتيح فرصاً جديدة للنظر في العمليات الإنمائية وراء الأساليب المتبعة حاليا.
Introduction
الدجاج الجنينية (Gallus gallus) كائن حي نموذجية ممتازة استخداماً في مجال البيولوجيا. فترة حضانة المرض ما يقرب من 21 يوما، ويمكن المحتضنة الكثير من البيض في وقت واحد، مما يجعل تجربة سريعة وفعالة. ولعل الأهم من ذلك، الجنين هو أيضا بسهولة التلاعب بها، تمكن الدراسة المستفيضة للعمليات الإنمائية الرئيسية والجينات والبروتينات التي تدفع هذه العمليات.
العين الدجاج الجنينية هو جهاز معقدة التي تنشأ عن طريق التفاعل بين عدد من أنسجة مختلفة مشابهة للعديد من أجهزة الجسم الأخرى. هذا الأسلوب يتيح لدراسة وضع هذه الأنسجة، ولا سيما في مراحل متقدمة من التنمية. على سبيل المثال، قد تكون الشبكية متعددة الطبقات ذات أهمية خاصة لأولئك الذين يدرسون تطوير النظام العصبي. الأساليب البديلة التي تمكن من دراسة أنسجة العين الأخرى كالقرنية والجسم فيتريل، العدسة، والصلبة العينية والجفون ذات فائدة للباحثين. العين الدجاج الجنينية يحتوي أيضا على سلسلة من العظام المسطحة، والعظيمات scleral، التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة تعريفية العظام إينتراميمبرانوس والتحجر في الفقاريات1.
حاليا، هناك عدد من الأساليب المستخدمة لدراسة التطور الجنيني. ميكروينجيكشنز الأجسام المضادة المثبطة أو غيرها الجزيئات المثبطة2،3، مزروع جراحيا ميكروبيدس غارقة في المانع4، وهي انهانسر5 كافة الأساليب التي يمكن استخدامها للجينات دوونريجولاتي أو البروتينات للاهتمام بجنين. وتستخدم أساليب مماثلة للبروتينات أوبريجولاتي. هذه الطرق لا تخلو من أوجه القصور. على سبيل المثال، عند استخدام المواد الكيميائية لتغيير وضع الجنين، يجب تقييم آثار قاتلة على الجنين، وهذا يحد من استخدام الأساليب المذكورة أعلاه للمواقع المترجمة للتطبيق عند التعرض لجرعات منخفضة بما يكفي لضمان استمرارية الجنين.
في المختبر استزراع الأنسجة قد استخدمت في طائفة واسعة من الكائنات الحية لدراسة التنمية ويمكن استخدامها لتجاوز بعض القيود المذكورة أعلاه. على سبيل المثال، فيمورى6وريشة براعم7،8، و أطرافه9 من الدجاج كل درست باستخدام أساليب، استزراع الأنسجة الخصيتين الماوس10 والجذور وينبع من النباتات11. تمنح هذه الأساليب العلماء بدرجة عالية من التحكم في تنمية الأنسجة، مثل القدرة على التقلب في درجة الحرارة وتغير توافر المغذيات. عزل الأنسجة من الجنين كله أيضا يجعلها أقل عرضه للآثار المميتة للمواد الكيميائية، مما يمكن التلاعب بدراسات على نطاق عالمي في تركيزات أعلى. هناك ميزة أخرى بارزة في المختبر استزراع هو الحفاظ على البيئة في الأنسجة الخلوية؛ ترتيب الأنسجة يظل دون تغيير نسبيا، مما يجعل من الممكن دراسة التفاعلات بين أنواع مختلفة من الأنسجة9. وهكذا، في المختبر استزراع يفتح الأبواب أمام إضافية تجريبية النهج غير متوفرة في النماذج في فيفو أو في ovo .
دراسة تطوير العين الدجاج الجنينية باستخدام المواد الكيميائية حاليا تحديا كبيرا. تغطية عدد من الأغشية اكسترامبريونيك الجنين، مما يجعل من الصعب على تطبيق ميكروبيدس أو المواد الكيميائية؛ الجنين أيضا جداً نشطة داخل البيضة كما يحصل كبار السن، مما زاد من تعقيد أسلوب صعبة بالفعل. هذا البروتوكول يتيح سهولة الوصول إلى العين والأنسجة المحيطة بها، إزالة هذه الحواجز، بينما توفر أيضا فرصاً جديدة دراسة العمليات الإنمائية داخل العين. تم إنشاء هذا البروتوكول لدراسة تنظيم دورات تعريفية العظيمات scleral داخل العين الجنينية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يجعل استخدام أنسجة المنشأة استزراع تقنيات لتحقيق نمو العين الدجاج من الجنينية يوم 8 (HH34) في المختبر لمدة 4 أيام. ووصف هذا الأسلوب استزراع الشبكة أصلاً تروويل15. نحن الأمثل بروتوكولا من بينتو وقاعة لعام 1991 دراسة16 استخدام غشاء شبه مسامية مع الشبكة…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر غريغوري هالر (جبل سانت فنسنت جامعة) لعمله الأولى في تطوير البروتوكول. أيضا يود المؤلفون أن يشكر نيكولاس جونز (جبل جامعة سانت فنسنت) للخبرة الفنية والمساعدة بتصوير وإنتاج الجزء السمعية والبصرية من المخطوطة. دانيال أندروز كانت مدعومة بتمويل من مسفو والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) عبر “تحكيم البحوث الطلابية الجامعية”. تمارا ألف فرانز-أوديندال معتمد من قبل “منحة اكتشاف الأموال”.
Materials
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
Riferimenti
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Biologia dello sviluppo. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Biologia dello sviluppo. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
