Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo
Summary
Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per crescere organi embrionali di pollo in vitro. Utilizzando questo metodo, lo sviluppo del tessuto embrionale pollo può essere studiato, pur mantenendo un elevato grado di controllo dell’ambiente di cultura.
Abstract
Il pollo embrionale è comunemente utilizzato come organismo modello affidabile per lo sviluppo dei vertebrati. L’accessibilità e l’incubazione breve periodo lo rende ideale per la sperimentazione. Attualmente, lo studio di queste vie inerenti allo sviluppo nell’embrione di pollo è condotto applicando inibitori e farmaci presso siti localizzati e alle concentrazioni basse utilizzando una varietà di metodi. La coltura in vitro del tessuto è una tecnica che consente lo studio dei tessuti separati dall’organismo ospite, evitando contemporaneamente molte delle limitazioni fisiche presenti quando si lavora con interi embrioni, come la suscettibilità degli embrioni per alte dosi di sostanze chimiche potenzialmente letale. Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per coltura l’embrionale pollo mezza testa in vitro, che presenta nuove opportunità per l’esame dei processi di sviluppo oltre i metodi attualmente stabiliti.
Introduction
Il pollo embrionale (Gallus gallus) è un organismo di modello eccellente comunemente utilizzato nel campo della biologia. Il periodo di incubazione è di circa 21 giorni e molte uova possono essere incubate contemporaneamente, rendendo sperimentazione rapido ed efficiente. Forse la cosa più importante, l’embrione è anche facilmente manipolabili, consentendo il vasto studio chiavi dei processi di sviluppo e dei geni e proteine che guidano questi processi.
L’occhio di pollo embrionale è un organo complesso che si sviluppa attraverso l’interazione di un numero di diversi tessuti simili a molti altri sistemi del corpo. Questo metodo consente lo studio dello sviluppo di questi tessuti, specialmente nelle fasi avanzate di sviluppo. Ad esempio, la retina a più strati può essere di particolare interesse per coloro che studiano lo sviluppo del sistema nervoso. Metodi alternativi che permettono lo studio di altri tessuti dell’occhio come la cornea, il corpo vitreal, la lente, la sclera e le palpebre sono di beneficio ai ricercatori. L’occhio embrionali di pollo contiene anche una serie di ossa piatte, gli ossicini sclerali, che possono essere utilizzati come un modello per lo studio di induzione dell’osso intramembranous e ossificazione in vertebrati1.
Attualmente, ci sono una serie di metodi utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale. Microiniezioni di anticorpi inibitori o altre molecole inibitorie2,3, impiantato chirurgicamente microsfere imbevuto di inibitore4, e5 di elettroporazione sono tutti metodi che possono essere utilizzato per downregulate geni o le proteine di interesse in un embrione. Metodi simili vengono utilizzati per aumentare il proteine. Questi metodi non sono senza loro limitazioni. Ad esempio, quando si utilizza sostanze chimiche per alterare lo sviluppo embrionale, devono essere valutati gli effetti letali sull’embrione, e questo limita l’utilizzo di metodi di cui sopra per siti localizzati di applicazione a dosi sufficientemente basse per garantire la sopravvivenza della dell’embrione.
La coltura in vitro del tessuto è stata utilizzata in una vasta gamma di organismi nello studio dello sviluppo e può essere utilizzata per ignorare alcune delle limitazioni di cui sopra. Ad esempio, i femori6, piuma germogli7,8e membra9 del pollo sono tutti stati studiati usando il tessuto di coltura metodi, come hanno i testicoli dei mouse10 e le radici e gambi di piante11. Questi metodi concedono gli scienziati un alto grado di controllo sullo sviluppo dei tessuti, come la possibilità di variare la temperatura e alterare la disponibilità di nutrienti. L’isolamento del tessuto dall’embrione intero rende anche molto meno sensibili agli effetti letali di sostanze chimiche, consentendo in tal modo gli studi di manipolazione su scala globale a concentrazioni più elevate. Un altro notevole vantaggio di in vitro coltura è la conservazione dell’ambiente cellulare del tessuto; la disposizione dei tessuti rimane relativamente invariata, rendendo possibile lo studio delle interazioni tra tessuto differenti tipi9. Così, in vitro coltura apre le porte a ulteriori sperimentale si avvicina non è disponibile in modelli in vivo o in ovo .
Attualmente, studiare lo sviluppo dell’occhio embrionale pollo usando i prodotti chimici è particolarmente impegnativo. Una serie di Membrane Extraembrionali copertina l’embrione, che lo rende difficile applicare microsfere o prodotti chimici; l’embrione è anche molto attivo all’interno l’uovo come esso invecchia, complicando ulteriormente un metodo già difficile. Questo protocollo consente un facile accesso all’occhio e relativi tessuti circostanti, eliminando queste barriere, fornendo nel contempo nuove opportunità per esaminare i processi inerenti allo sviluppo all’interno dell’occhio. Questo protocollo è stato istituito per studiare l’induzione dei ossicles scleral all’interno dell’occhio embrionale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo si avvale del tessuto consolidato tecniche di coltura per ottenere la crescita di un occhio di pollo da embrionale giorno 8 (HH34) in vitro per 4 giorni. Questo metodo di coltura griglia fu originariamente descritto da Trowell15. Abbiamo ottimizzato un protocollo da Pinto e di Hall 1991 Studio16 utilizzando una membrana semi-porosa con griglia per studiare segnali induttivi tra strati di tessuto separati del pollo embrionale occhio<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Gregory Haller (Mount Saint Vincent University) per il suo lavoro preliminare nello sviluppo del protocollo. Gli autori inoltre vorrei ringraziare Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) per la sua competenza tecnica e assistenza con le riprese e la produzione della parte audio/visivo del manoscritto. Daniel Andrews è stato sostenuto da finanziamenti da MSVU e scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) tramite un Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal è sostenuta da una sovvenzione di scoperta di NSERC.
Materials
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
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