Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

Summary

Her presenterer vi en organotypic dyrking protokollen å vokse embryonale kylling organer i vitro. Bruker denne metoden, kan utviklingen av embryonale kylling vev studeres, samtidig opprettholde en høy grad av kontroll over kultur miljøet.

Abstract

Embryonale kylling er ofte brukt som en pålitelig modell organisme for virveldyrenes utvikling. Sin tilgjengelighet og kort inkubering gjør periode det ideelt for eksperimentering. Foreløpig er studiet av disse utviklingsmessige stier i kylling embryoet utført ved å bruke hemmere og narkotika lokaliserte områder og lave konsentrasjoner bruker en rekke metoder. In vitro vev dyrking er en teknikk som muliggjør studiet av vev atskilt fra verten organisme, mens samtidig omgåelsen mange av fysiske begrensninger når arbeider med hele embryoer, som mottakelighet av embryo til høye doser av potensielt dødelig kjemikalier. Her presenterer vi en organotypic dyrking protokoll for dyrking av embryonale chicken halv hodet i vitro, som presenterer nye muligheter for undersøkelse av utviklingsprosesser utover metodene er etablert.

Introduction

Embryonale kylling (Gallus gallus) er en utmerket modell organisme brukte innen biologi. Inkubasjonstiden er omtrent 21 dager og mange egg kan være inkubert samtidig gjør eksperimentering raskt og effektivt. Kanskje viktigst, embryoet også enkelt endres, slik at den omfattende undersøkelsen av viktige utviklingsprosesser og gener og proteiner som driver disse prosessene.

Embryonale kylling øyet er en komplisert organ som utvikler via samspillet av en rekke forskjellige vev lik for mange andre kroppens systemer. Denne metoden muliggjør studiet av utviklingen av disse vev, særlig i avanserte stadier av utviklingen. For eksempel kan flerlags netthinnen være av spesiell interesse for de som studerer utvikling av nervesystemet. Alternative metoder som muliggjør studiet av andre øye vev som hornhinnen, vitreal kroppen, linsen, sclera og øyelokkene er til nytte for forskere. Kylling embryonale øyet inneholder også en rekke flate bein, Innbukking ossicles, som kan brukes som modell for studiet av intramembranous bein induksjon og forbening i virveldyr¹.

Foreløpig er det en rekke metoder for å studere embryonale utvikling. Microinjections hemmende antistoffer eller andre hemmende molekyler^2,3, implantert kirurgisk microbeads dynket i hemmer⁴og electroporation⁵ er alle metoder som kan brukes til å downregulate gener eller proteiner av interesse i et embryo. Lignende metoder brukes upregulate proteiner. Disse metodene er ikke uten sine begrensninger. For eksempel når du bruker kjemikalier endre embryonale utviklingen, dødelige effekten på fosteret må vurderes, og dette begrenser bruken av de nevnte metodene lokaliserte områder av programmet ved doser lav nok til å sikre survivability av den fosteret.

In vitro vev dyrking er brukt i en rekke organismer for å studere utviklingen og kan brukes til å omgå noen av nevnte begrensningene. For eksempel har i femora⁶, fjær knopper^7,8og lemmer⁹ av kylling alle blitt studert ved hjelp av vev dyrking metoder, som har prøvene av musen¹⁰ og røtter og stengler planter¹¹. Disse metodene gi forskerne en høy grad av kontroll over den vev utviklingen, svinger temperaturen og endre næringsstoffer tilgjengeligheten. Isolasjon av vev fra hele fosteret gjør det også langt mindre utsatt for dødelige virkningen av kjemikalier, dermed muliggjør manipulasjon studier på en global skala på høyere konsentrasjoner. En annen betydelig fordel av i vitro dyrking er bevaring av vevets mobilnettet miljø; ordningen av vev forblir relativt uendret, gjør det mulig å studere interaksjonen mellom ulike vev typer⁹. Dermed tilnærminger i vitro dyrking åpner dørene til flere eksperimentelle ikke tilgjengelig i vivo eller ovo modeller.

For tiden er studerer utviklingen av embryonale kylling øyet bruker kjemikalier spesielt utfordrende. En rekke extraembryonic membraner dekke embryoet, gjør det vanskelig å bruke microbeads eller kjemikalier; fosteret er også svært aktiv i egg som det blir eldre, ytterligere kompliserende en allerede vanskelig metode. Denne protokollen gir enkel tilgang til øyet og dens omkringliggende vev, eliminere disse barrierene, gir nye muligheter til å undersøke utviklingsprosesser i øyet. Denne protokollen ble etablert for å studere induksjon av Innbukking ossicles i embryonale øyet.

Protocol

Merk: For fosteret stadier, benytte de Hamburger og Hamilton12 (HH) avholder tabell. 1. embryo inkubasjon Ruge befruktet kylling egg i en steril, temperaturkontrollert inkubator på 37 ° C ± 1 ° C og ~ 40% fuktighet. Slå egg 1 x per dag og tillate dem å ruge til HH34 (8 dager etter befruktning). 2. forberedelse og sterilisering av materialet For 12 embryoer, autoklav 2 L destillert vann, 1 L 0,85% chic…

Representative Results

Bruker denne metoden, kan øye embryonale kylling kultivert fra dag 8 av sin utvikling (HH34) i vitro for 4 dager. Fire dager i ovo utvikling tilsvarer HH38. Denne culturing metoden støtter utviklingen av fjær knopper rundt øyet og på øyelokkene (figur 1B). Disse fjær knopper er ikke tilstede i ovo på HH34 før dyrking (figur 1A), indik…

Discussion

Denne protokollen gjør bruk av etablerte vev dyrking teknikker for å oppnå vekst av en kylling øye fra embryonale dag 8 (HH34) i vitro for 4 dager. Denne rutenett-dyrking metoden ble opprinnelig beskrevet av Trowell¹⁵. Vi har optimalisert en protokoll fra Pinto og Hall 1991 studien¹⁶ utnytte en semi porøs membran med rutenett å studere induktiv signaler mellom separerte vev lag av embryonale kylling øye¹⁵. Bruker denne metoden, kultiv…

Materials

35 mm cell culture petri dishes	Corning	353001	easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
100 mm cell culture petri dishes	Corning	353003	tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
paper tissue	Kimtech	34155	Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton
wire mesh	n/a	n/a	stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)
disposable glass pipettes	VWR	14673-010	Borosilicate glass disposable 5 3/4"
nutrient medium	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)
penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised
filter paper	Whatman	1454 090	semi-porous filter paper 90mm
fertilized chicken eggs	Dalhousie University Agricultural College	n/a	can be obtained from local farms
sodium chloride (NaCl)	EMD	SX0420-3	sodium chloride crystals, reagent grade
1 L glass bottle	VWR	89000-240	1 L pyrex autoclavable glass bottle
ethanol	Fisher Scientific	BP82011	70% molecular biology grade
tupperware containers	n/a	n/a	store-bought and sterilized with EtOH
disposable razor blades	VWR	55411-050	single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)
plastic spoons	n/a	n/a	store-bought and sterilized with EtOH
dust mask	3M	n/a	3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	paraformaldehyde, reagent grade, crystalline
neutral-buffered formalin	Fisher Scientific	72210	10% neutral buffered formalin
phosphate buffered saline (PBS)	n/a	n/a	10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes	VWR	21008-216	presterilized centrifuge tubes
forceps	FST	n/a	fine forceps
chick saline	n/a	n/a	0.85% NaCl
tinfoil	n/a	n/a	store-bought
paper towel	n/a	n/a	store-bought