Denne protokollen beskriver avgjørende skritt og forholdsregler må utføre enkeltcelle multiplex omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjons etter oppdateringen-klemme. Denne teknikken er en enkel og effektiv metode for å analysere uttrykk profilen til et forhåndsbestemt sett av gener fra en enkeltcelle preget av oppdateringen-klemme innspillinger.
Hjernebarken består tallrike celletyper viser ulike morfologiske, fysiologiske og molekylære funksjoner. Dette mangfoldet vanskeliggjør enkel identifisering og karakterisering av disse celletyper, forutsetninger for å studere sine bestemte funksjoner. Denne artikkelen beskriver multiplex enkeltcelle omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR) protokoll, som gjør, etter oppdateringen-klemme i skiver, å oppdage samtidig uttrykket av gener i en enkelt celle. Denne enkle metoden kan gjennomføres med morfologiske karakterisering og gjelder vidt bestemme fenotypiske trekk av ulike celletyper og deres mobilnettet miljø, som i blodkar. Prinsippet om denne protokollen er å spille inn en celle med patch-klemme teknikken, å høste og reversere transkribere cytoplasmatiske innholdet, og for å oppdage kvalitativt uttrykk for et forhåndsdefinert sett av gener av multiplex PCR. Det krever en forsiktig design av PCR primere og intracellulær patch-klemme løsningen kompatibel med RT PCR. For å sikre en selektiv og pålitelig transkripsjon krever oppdagelsen, denne teknikken også egnede kontroller fra cytoplasma høsting forsterkning trinn. Selv om forholdsregler diskutert her må følges strengt, kan nesten alle elektrofysiologiske laboratorium bruke multiplex enkeltcelle RT PCR teknikk.
Hjernebarken består tallrike celletyper involvert i ulike fysiologiske prosesser. Deres identifikasjon og karakterisering, en forutsetning for forståelsen av deres bestemte funksjoner, kan være svært utfordrende gitt store morfologiske, fysiologiske og molekylære mangfoldet som kjennetegner kortikale cellen typer1 ,2,3,4.
Encellede multiplex RT PCR er basert på kombinasjonen av oppdateringen-klemme og RT PCR teknikker. Det kan sonde samtidig uttrykket av mer enn 30 forhåndsdefinerte gener i electrophysiologically identifiserte celler5. Inkludering av en neuronal tracer i innspillingen pipette videre lar morfologiske karakterisering av innspilte cellene etter histochemical åpenbaring6,7,8,9, 10. det er en svært nyttig teknikk for klassifisering av neuronal typer basert på multivariat analyse av deres fenotypiske trekk5,9,10,11,12 ,13,14. Enkelt celle multiplex RT PCR passer også karakterisering av ikke-neuronal celler som astrocyttene15,16,17, og kan brukes nesten hver hjernen strukturen18, 19,20,21,22,23 og celle type, forutsatt at de kan bli registrert i hele celle konfigurasjon.
Denne teknikken er veldig praktisk for identifikasjon av mobilnettet kilder og/eller mål overføring systemer7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, spesielt når spesifikke antistoffer mangler. Det avhenger av oppdateringen-klemme opptak fra visuelt identifiserte celler29og dermed også lar målretting av celler i en bestemt mobile miljøet8,15,16. Videre siden cytoarchitecture av hjernevev er bevart i hjernen skiver, gir dette også studier av anatomisk relasjonene preget cellene med neuronal og ikke-neuronal elements7,8 , 18.
Siden denne teknikken er begrenset av mengden høstet cytoplasma og effektiviteten av RT, kan gjenkjenning av mRNA uttrykt på antall lave Kopier være vanskelig. Selv om andre tilnærminger basert på RNaseq teknologi tillater for å analysere det hele transcriptome enkeltceller3,4,30,31, trenger de høy gjennomstrømming dyre sequencere ikke nødvendigvis tilgjengelig for hvert laboratorium. Siden enkeltcelle multiplex RT PCR teknikken bruker end-point PCR, krever det bare tilgjengelig thermocyclers. Den lett kan utvikles i laboratorier utstyrt med elektrofysiologiske set-ups krever ikke dyrt utstyr. Det kan gi, innen en dag, en kvalitativ analyse av uttrykk for et forhåndsdefinert sett av gener. Dermed gir denne tilnærmingen lett tilgjengelighet til molekylær karakterisering av enkeltceller på en rask måte.
Enkelt celle multiplex RT PCR etter oppdateringen-klemme kan samtidig og pålitelig sonde uttrykket av mer enn 30 gener i electrophysiologically identifiserte celler5. Analysere genuttrykk på enkeltcelle nivå krever svært effektiv PCR primere. En av de mest begrensende trinnene er samling av innholdet i cellen. Effektiviteten avhenger av diameteren på oppdateringen pipette spissen, som må være så stor som mulig samtidig som cellestørrelsen. Pipetter med 1-2 µm åpne tips diameter ble påv…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Alexandre Mourot for hans kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 og ANR-17-CE37-0010-03), BLG støttes av fellesskap fra Fondation pour la Recherche sur Alzheimers. Vi takker dyr anlegget å IBPS (Paris, Frankrike).
MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
BT10 Series – 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
BT20 Series – 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
BT200 Series – 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |