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Neuroscienze

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

Published: June 20, 2018
doi:
10.3791/57627
, , ,
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine – Institut de Biologie Paris Seine (NPS – IBPS),Sorbonne Université

Summary

Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

Abstract

O córtex cerebral é composto de numerosos tipos de células exibindo várias características morfológicas, fisiológicas e moleculares. Esta diversidade dificulta a fácil identificação e caracterização destes tipos de células, os pré-requisitos para estudar suas funções específicas. Este artigo descreve o multiplex única célula transcrição reversa do polymerase reação em cadeia (RT-PCR) protocolo, que permite, depois da gravação em fatias, remendo-braçadeira para detectar, simultaneamente, a expressão de dezenas de genes em uma única célula. Este método simples pode ser implementado com caracterização morfológica e é amplamente aplicável para determinar as características fenotípicas de vários tipos de células e seu ambiente celular particular, como na proximidade de vasos sanguíneos. O princípio do presente protocolo é gravar uma célula com a técnica patch-clamp, colheita e inverter transcreva seu conteúdo citoplasmático, e para detectar qualitativamente a expressão de um conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requer um design cuidadoso dos iniciadores de PCR e intracelular remendo-braçadeira solução compatível com RT-PCR. Para garantir uma transcrição seletiva e confiável detecção, esta técnica também exige controles apropriados do citoplasma colheita às etapas de amplificação. Embora discutido aqui deve ser rigorosamente as precauções, praticamente qualquer laboratório eletrofisiológico pode usar célula única técnica de RT-PCR multiplex.

Introduction

O córtex cerebral é composto por numerosos tipos de células envolvidos em vários processos fisiológicos. Sua identificação e caracterização, um pré-requisito para a compreensão de suas funções específicas, podem ser muito desafiadoras dada a grande diversidade morfológica, fisiológica e molecular que caracteriza tipos de célula cortical1 ,2,3,4.

Célula única multiplex RT-PCR baseia-se na combinação da remendo-braçadeira e técnicas de RT-PCR. Ele pode sondar simultaneamente a expressão de mais de 30 genes predefinidos em células electrophysiologically identificadas5. A inclusão de um marcador neuronal em gravação pipeta mais permite a caracterização morfológica das células gravadas após a revelação histochemical6,7,8,9, 10. é uma técnica muito útil para a classificação dos tipos neuronais com base na análise multivariada de suas características fenotípicas5,9,10,11,12 ,13,14. Única célula multiplex RT-PCR é também adequado para a caracterização de células não-neuronais como astrócitos15,16,17e pode ser aplicado virtualmente a cada cérebro estrutura18, 19,20,21,22,23 e célula tipo, supondo que eles podem ser gravados em configuração de células inteiras.

Esta técnica é muito conveniente para a identificação das fontes de celulares e/ou alvos de transmissão sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,,27,28, especialmente quando os anticorpos específicos são escassos. Ele se baseia em gravações de remendo-braçadeira de células visualmente identificados29e assim também permite a segmentação de células em um ambiente celular específico8,15,16. Além disso desde a cytoarchitecture do tecido cerebral é preservada em fatias do cérebro, essa abordagem também permite que o estudo das relações anatômicas das células caracterizadas com elementos neuronais e não-neuronal7,8 , 18.

Uma vez que esta técnica é limitada pela quantidade de citoplasma colhida e pela eficiência do RT, a detecção de mRNA, expressado em número de cópia baixa pode ser difícil. Embora outras abordagens baseadas na tecnologia RNaseq permitem analisar a transcriptoma inteira de células únicas3,4,30,31, não necessariamente precisam de sequenciadores caros elevado-throughput disponível para todos os laboratórios. Desde que a técnica de RT-PCR multiplex única célula usa pontos de extremidade do PCR, exige somente thermocyclers amplamente disponível. Ele pode ser facilmente desenvolvido em laboratórios equipados com instalações eletrofisiológicas e não requer equipamento caro. Ele pode fornecer, dentro de um dia, uma análise qualitativa da expressão de um conjunto predefinido de genes. Assim, esta abordagem oferece um fácil acesso para a caracterização molecular das células individuais de forma rápida.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais utilizando animais foram realizados em estrita conformidade com os regulamentos franceses (Código Rural R214/87-R214/130) e em conformidade com as diretrizes éticas da Comunidade Económica Europeia (86/609/CEE) e a carta nacional francês sobre a ética da experimentação animal. Todos os protocolos foram aprovados pelo Comitê de ética de Charles Darwin e enviados para o Ministério da educação e pesquisa (aprovação 2015 061011367540). As instalações de animais IBPS é cre…

Representative Results

Uma validação representante de RT-PCR multiplex é mostrada na Figura 3. O protocolo foi concebido para sondar, simultaneamente, a expressão de 12 diferentes genes. O vGluT1 de transporte vesicular glutamato foi tomada como um controle positivo para glutamatérgico neurônios42. O GABA sintetizando enzimas (GAD65 e 67 GAD), neuropeptídeo Y (NPY) e somatostatina (SOM) foram utilizados como marcadores de gabaérgica interneurônios<s…

Discussion

Única célula multiplex RT-PCR após remendo-braçadeira pode sondar simultaneamente e de forma confiável a expressão de mais de 30 genes em células electrophysiologically identificadas5. Analisando a expressão do gene no nível da célula única requer iniciadores de PCR altamente eficientes. Um dos passos mais limitantes é a coleção de conteúdo da célula. Sua eficiência depende do diâmetro da ponta da pipeta de patch, que deve ser tão grande quanto possível enquanto o tamanho de pi…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. Alexandre Mourot por seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por concessões da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG é suportado pelo fellowship da Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos a facilidade animal do IBPS (Paris, França).

Materials

MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series – 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series – 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series – 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation
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Riferimenti

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Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).
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