Sote sopp forårsaker mange ødeleggende landbruket sykdommer. De er spredt som sovende teliospores som spirer svar på miljømessige signaler. Vi skissere to metoder for å undersøke molekylær endringer under spiring: måle åndedrett økning for å oppdage metabolske aktivisering og vurdere endre molekylære hendelser ved å isolere teliospores på forskjellige morfologiske stadier.
Sote sopp er paranoid agenter for flere ødeleggende landbruket sykdommer. De er preget av produksjon av teliospores, som er tykke vegger spredning agenter. Teliospores kan forbli sovende i flere tiår. Dormancy er preget av lav metabolsk priser og stanset macromolecular biosyntesen sterkt reduserte nivåer av åndedrett. Ved mottak av nødvendige Miljøsignaler, spire teliospores for å produsere haploid celler, som kan starte nye runder av infeksjon. Teliospore spiring er preget av gjenopptakelse av macromolecular biosyntesen, økt åndedrett og dramatiske morfologiske endringer. For å presist måle endringer i cellular respirasjon i den tidlige fasen av spirende, har vi utviklet en enkel protokoll ansette en Clark-type respirometer. Av spiring kjennetegnes av bestemte morfologiske endringer, men spiring er asynkron. Vi utviklet en microdissection teknikk som gjør det muliggjør for oss å samle inn teliospores på forskjellige spiring stadier.
Den sote sopp (Ustilaginales) består av over 1600 arter som infisere gress inkludert viktig frokostblanding avlinger av korn, bygg og hvete, forårsaker milliarder av dollar i avling tap årlig1. Disse sopp er preget av produksjon av teliospores, som har mørkt pigmentert cellevegger og er spredning agenter. Teliospores for å skjerme genetisk materiale under hverdagens stress spredning mellom verten planter, og kan vedvare i en sovende tilstand for år2. Slik er teliospores en avgjørende del av sykdom spread.
For å studere teliospore biologi, utnytter vårt laboratorium modell sote soppen Ustilago maydis (U. maydis), som er den kausale agenten for sykdommen ‘vanlige sote korn’. Eldre U. maydis teliospores kjennetegnes av vekst arrestasjon, redusert cellenes stoffskifte og lave nivåer av cellular respirasjon3. I gunstige miljømessige forhold (f.eks., tilstedeværelse av bestemte sukker), U. maydis teliospores spirer og fullføre meiose, produksjon av basidiospores som kan starte nye runder av infeksjon. Spiring er preget av økt åndedrett, tilbake til metabolske aktiviteten og progresjon gjennom observerbare morfologiske stadier av spiring4.
Den innledende fasen av spiring inkluderer økt åndedrett og metabolsk funksjon, men det finnes ingen morfologiske indikasjoner for endring. Opprinnelige målinger av luftveiene endringen i U. maydis ble utført over 50 år siden, måle oksygenforbruk manometrically med en Warburg kolbe apparater5. Vi har utviklet en ny, enkel metode for å studere nøyaktig endringer i åndedrett under teliospore spiring ved å måle oksygenforbruk en gang løpet av spiring bruker en Clark-type microrespirometer. Vi har tidligere anvendt denne metoden for å studere endringer i respirasjonsfrekvens mellom vill-type U. maydis haploid celler og mutanter med defekt mitokondrier6, og har tilpasset protokollen her for å studere endringer i teliospore åndedrett under spiring. Dette gir et middel til å nøyaktig identifisere tidspunktet for åndedrett endre slik at vi kan målrette teliospores på riktig tidspunkt etter initiering av spiring undersøke tidlig molekylære hendelser. Utviklingen av spiring kan følges mikroskopisk når promycelia kommer fra teliospore, men den asynkrone måten hemmet isolering av nok teliospores på et gitt tidspunkt for undersøkelse. Vi utviklet en microdissection teknikk som ligner på de som brukes for i vitro fertilisering fysisk samle teliospores på forskjellige morfologiske stadier av spiring.
Basidiomycete biotrophic plante patogener føre milliarder av dollar i avling tap årlig. De aller fleste av disse patogener produsere teliospores som er integrert i fungal spredning og seksuell reproduksjon. Få kunnskap om utvikling og spiring av teliospores er avgjørende for å forstå spredning av ødeleggende sykdommer forårsaket av disse sopp. For å identifisere molekylær endringer på sentrale kontrollpunktene har vi utviklet en metode for å identifisere tidspunktet for fysiologiske endringer, og en annen for…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Paul Frost for bruk av hans microrespirometer, og Nicole Wagner og Alex Bell for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av en NSERC grant å B.J.S.
Streptomycin Sulfate | BioShop | STP101 | |
Kanamycin Sulfate | BioShop | KAN201 | |
Potato Dextrose Broth | BD Difco | 254920 | |
1 L Waring Laboratory blender | Waring | 7011S | |
Cheesecloth | VWR | 470150-438 | |
Nalgene Polypropylene Desiccator with Stopcock | ThermoFisher Scientific | 5310-0250 | |
Unisense MicroRespiration system | |||
MicroRespiration Sensor (O2) | Unisense | OX10 | |
MicroOptode Meter Amplifier | Unisense | N/A | |
MR-Ch Small | Unisense | MR-Ch | |
SensorTrace Rate Software | Unisense | N/A | |
MicroRespiration Rack | Unisense | MR2-Rack | |
MicroRespiration Stirrer | Unisense | MR2-Co | |
Microdissection system | |||
Axio Vert.A1 Inverted Light Microscope | Zeiss | ||
Coarse Manipulator | Narishige | MMN-1 | |
Three-axis Hanging Joystick Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-202ND | |
Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
TransferTip (ES) | Eppendorf | 5175107004 |