عزل الخلايا الدبقية المعوي من سوبموكوسا والصفيحة بروبريا الماوس الكبار
Summary
وهنا يصف لنا عزل الخلايا المعوية الدبقية من الأمعاء سوبموكوسا استخدام متسلسلة يدتا إينكوبيشنز يخلب الكاتيونات ديفالينت والحضانة في الخلية غير الانزيمية حل الاسترداد ثم. تصفيح تعليق الخلية الناتجة في بولي-د-يسين و laminin النتائج في ثقافة مخصب بدرجة عالية من الخلايا الدبقية سوبموكوسال للتحليل الوظيفي.
Abstract
الجهاز العصبي المعوي (ENS) يتكون من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية المعوي (اجكس) الموجودة داخل الجدار العضلات الملساء وسوبموكوسا وبروبريا الصفيحة. اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن الغريزي عن طريق الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، ويسهم في سلامة الحاجز الظهارية. معظم الدراسات الأولية الثقافات الدبقية المعوي استخدام الخلايا المعزولة من الضفيرة myenteric بعد الانفصال الانزيمية. هنا، يتم وصف أسلوب غير الانزيمية لعزل والثقافة اجكس من سوبموكوسا المعوية والصفيحة بروبريا. بعد الإزالة اليدوية لطبقة العضلات الطولية، تم تحرير اجكس من الصفيحة بروبريا وسوبموكوسا باستخدام إينكوبيشنز يدتا مخزنة حبيس متسلسلة تليها الحضانة في حل الاسترداد المتوفرة تجارياً الخلية غير الانزيمية. إينكوبيشنز يدتا كانت كافية لتجريد معظم المخاطية الظهارية من بروبريا الصفيحة، مما يتيح حل الاسترداد خلية لتحرير اجكس submucosal. تم تجاهل أي بقايا الصفيحة بروبريا والعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع إطلاق مينتيريك. وحددت اجكس بسهولة بقدرتها على التعبير عن البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني). فقط حوالي 50% تعليق خلية الواردة توصيني + الخلايا بعد إكمال إينكوبيشنز الأنسجة وقبل الطلاء على الركازة بولي-د-يسين/لامينين. ومع ذلك، بعد 3 أيام من استزراع الخلايا في معامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)-التي تحتوي على وسائط الثقافة، السكان خلية التمسك بلوحات المغلفة بالركيزة تتألف من > إطلاق المعوي 95%. قمنا بإنشاء خط الفأر هجين بتربية ماوس هجفاب-لجنة المساواة العرقية إلى خط مراسل تدتوماتو روزا لتعقب النسبة المئوية توصيني + الخلايا باستخدام صف الخلية الذاتية. وهكذا، يمكن عزلة بواسطة أساليب غير الانزيمية إطلاق المعوية غير مينتيريك ومثقف لمدة 5 أيام على الأقل.
Introduction
الفائدة في وظيفة الخلايا الدبقية المعوي (اجكس) يزداد باطراد بسبب أدوارها المعترف بها في القناة الهضمية النزاهة والتوازن1،2. وباﻹضافة إلى ذلك، اجكس تختلف باختلاف مواقعها على طول غي المسالك3،4. اجكس الإفراج عن مختلف العوامل التغذوية، بما في ذلك عامل نيوروتروفيك المستمدة من الخلايا الدبقية (جدنف)، والمساهمة في القناة الهضمية حركية1،5 والرد على تركات الميكروبية6،7. وقد بينت الدراسات أن السكان الغانية غير متجانسة وأن وظيفتها تختلف تبعاً لما إذا كانت هي سوبموكوسال أو الموجودة ضمن ال1،الضفيرة مينتيريك7. على سبيل المثال، تسهم اجكس داخل سوبموكوسا تقاطعات ضيق8. وربطت التفاضلية التعبير توصيني والفسفره في اجكس لمرض باركنسون، مما يوحي باحتمال وجود صلة للنمط الظاهري القناة الهضمية من هذا الاضطراب9. في الآونة الأخيرة، لوحظ أن فقدان مينين البروتين النووي في ثقافات منعزلة من اجكس من سوبموكوسا المعوية الدانية كافية للحث على التعبير عن هرمون جاسترين10. كنتيجة لذلك، اقترح أن اجكس قد يكون منشأ الإثناعشرية gastrinomas، نوع من ورم الغدد الصم العصبية10. جماعياً، وهذه الأمثلة تؤكد أهمية دراسة السلوك ووظيفة اجكس معزولة في اضطرابات الأعصاب والسرطان11.
ويظل التحدي هو في المجال كيفية عزل ودراسة أحد أو كلا الغانية السكان في المختبر. النسب تتبع التجارب أثبتت أن اجكس في سوبموكوسا والصفيحة بروبريا تنشأ من خلايا السلف في ضفيرة مينتيريك7. على الرغم من أن هناك عدة بروتوكولات العزلة المنشورة المتاحة لتوليد ثقافات myenteric اجكس12،13،،من1415،،من1617، 18،19، لا تستهدف على وجه التحديد عزلة السكان الغانية بروبريا submucosal/الصفيحة. على وجه التحديد استخدام البروتوكولات القائمة لعزل الغانية مزيجاً من فصل الميكانيكية أو ميكروديسيكشن للعضلات الملساء جنبا إلى جنب مع تفكك الانزيمية، في نهاية المطاف التخلص من طبقة الخلايا المخاطية.
والهدف من هذه المخطوطة إظهار الخطوات لعزل غير انزيماتيكالي اجكس الأولية من بروبريا الصفيحة للدراسات في المختبر . نظراً لوجود لا علامات على وجه التحديد التمييز بين اجكس myenteric من تلك الموجودة في سوبموكوسا، استغلت الفصل المكاني بين المخاطية الظهارية من العضلات الملساء لعزل اجكس submucosal. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق الجمع بين أدتا استخلاب مع الانفصال غير الانزيمية، عزلت اجكس عن submucosa خلافا للعضلات الملساء، قد تم تجاهلها جنبا إلى جنب مع اجكس myenteric جملة المرتبطة بها. حدث آخر فصل سوبموكوسا واجكس بروبريا الصفيحة باستزراع الخلايا على ركائز الصديقة للخلية الدبقية، مثلاً، بولي-د-يسين ولامينين.
Protocol
Representative Results
Discussion
اجكس تلعب أدواراً هامة في التوازن القناة الهضمية، ومن الضروري أن عزل ودراستها في المختبر. في هذا البروتوكول، قدم طريقة بسيطة لعزل اجكس من بروبريا الصفيحة الأمعاء الماوس الكبار لدراسة وظيفة الدبقية المعوي.
إزالة مساريق ملتصقة ولممب مع مسحه القطن يزيل بعض من إطلاق إنتر-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أتمنى أن نعترف بدعم من DK045729 R37 (إلى جلم)، AR060837 R01 (إلى HX) وجامعة ميشيغان الجهاز الهضمي بحوث مركز الجزيئية الأساسية P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
Riferimenti
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
