Isolatie van darmen gliale cellen uit de Submucosa en de Lamina Propria van de volwassen muis
Summary
Hier beschrijven we de isolatie van darmen-gliale cellen uit de intestinale submucosa-sequentiële EDTA incubations met divalente kationen en vervolgens incubatie in de oplossing van de gegevensterugwinning van de niet-enzymatische cel chelaat. De resulterende celsuspensie op poly-D-lysine en laminin plating resulteert in een sterk verrijkt cultuur van submucosal gliacellen voor functionele analyse.
Abstract
De darmen zenuwstelsel (ENS) bestaat uit neuronen en darmen gliale cellen (EGCs) die zich binnen de gladde spieren muur, de submucosa en de lamina propria bevinden. EGCs spelen een belangrijke rol in de homeostase van de darm door de vrijlating van verschillende trofische factoren en bijdragen tot de integriteit van de epitheliale barrière. De meeste studies van primaire darmen gliale culturen cellen geïsoleerd van de plexus myenteric na enzymatische dissociatie gebruiken. Hier, wordt een niet-enzymatische methode te isoleren en cultuur EGCs van de intestinale submucosa en de lamina propria beschreven. Na handmatige verwijdering van de Musculus longitudinalis laag, werden EGCs bevrijd van de lamina propria en de submucosa, met behulp van opeenvolgende HEPES-buffer EDTA incubations gevolgd door incubatie in de oplossing van de gegevensterugwinning van de verkrijgbare niet-enzymatische cel. De incubations EDTA volstonden om te strippen allermeest naar de epitheliale mucosa uit de lamina propria, waardoor de oplossing van de gegevensterugwinning cel te bevrijden van de submucosal EGCs. Eventuele resterende lamina propria en gladde spieren werd verwijderd samen met de myenteric-glia. EGCs waren gemakkelijk geïdentificeerd door hun vermogen om te uiten gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP). Slechts ongeveer 50% van de celsuspensie bevatte GFAP + cellen na het voltooien van weefsel incubations en voorafgaand aan plating op het poly-D-lysine/laminin substraat. Echter na 3 dagen voor het kweken van de cellen in gliale cel-afgeleide neurotrophic factor (GDNF)-met cultuurmedia, de bevolking van de cel vast te houden aan de substraat-gecoate platen bestaat uit > 95% darmen glia. We een hybride muis lijn gemaakt door het fokken van een hGFAP-Cre muis om de lijn van de verslaggever ROSA-tdTomato voor het bijhouden van het percentage van GFAP + cellen met behulp van endogene cel fluorescentie. Dus, niet-myenteric darmen glia kan worden geïsoleerd door niet-enzymatische methoden en gekweekte gedurende ten minste 5 dagen.
Introduction
Interesse in de functie van de darmen gliale cellen (EGCs) is gestaag toegenomen als gevolg van hun erkende rollen in de darm integriteit en homeostase1,2. EGCs is bovendien afhankelijk van hun locatie langs de lengte van de GI tract3,4. EGCs release verschillende trofische factoren, met inbegrip van gliale cel-afgeleide neurotrophic factor (GDNF), bijdragen tot de darm motiliteit1,5 en reageren op microbiële bijproducten6,7. Studies hebben aangegeven dat de EGC populatie heterogeen is en dat hun functie is afhankelijk van of ze submucosal zijn of zich bevinden binnen de myenteric plexus1,7. Bijvoorbeeld, bijdragen EGCs binnen de submucosa aan strakke kruispunten8. Differentiële expressie van het algemeen kaderakkoord voor vrede en fosforylatie in EGCs zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson, suggereren hun mogelijke link naar het fenotype van de darm van deze stoornis9. Onlangs, werd naar voren gebracht dat het verlies van de nucleaire eiwit menen in geïsoleerde culturen van EGCs van de proximale intestinale submucosa voldoende was voor het opwekken van expressie van het hormoon gastrine10. Dientengevolge, werd voorgesteld dat EGCs zou de oorsprong van duodenale gastrinoom, een soort neuro-endocriene tumor10. Collectief, onderstrepen deze voorbeelden het belang van het bestuderen van het gedrag en de functie van geïsoleerde EGCs in neuropatische aandoeningen en kanker11.
De uitdaging op het gebied blijft hoe te isoleren en bestuderen een of beide EGC populaties in vitro. Lineage trace experimenten aangetoond dat EGCs in de submucosa en de lamina propria zijn afkomstig uit voorlopercellen in de plexus myenteric7. Hoewel er verschillende gepubliceerde isolatie protocollen die beschikbaar zijn voor het genereren van de culturen van myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, geen specifiek gericht op isolatie van de submucosal/lamina propria EGC bevolking. Bestaande protocollen voor EGC isolatie meer specifiek gebruiken een combinatie van de mechanische scheiding of de microdissection van de gladde spieren gecombineerd met enzymatische dissociatie, uiteindelijk de mucosal cellaag teruggooi.
Het doel van dit manuscript is om aan te tonen de stappen voor het niet-enzymatisch isoleren primaire EGCs uit de lamina propria voor in vitro studies. Aangezien er geen markeringen die specifiek onderscheid myenteric EGCs in de submucosa, was de ruimtelijke scheiding van de epitheliale mucosa van de gladde spieren benut om submucosal EGCs isoleren. Bovendien, door het combineren van EDTA chelatie met niet-enzymatische dissociatie, waren EGCs geïsoleerd uit de submucosa in tegenstelling tot de gladde spieren, die samen met de bijbehorende inter-myenteric EGCs werd verworpen. Verdere scheiding van de submucosa en de lamina propria EGCs opgetreden door het kweken van de cellen gliale cel-vriendelijke substraten, bijvoorbeeld, poly-D-lysine en laminin.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs spelen een belangrijke rol in de homeostase van de darm, en het is essentieel om te isoleren en bestuderen ze in vitro. In dit protocol, een eenvoudige methode voor het isoleren van EGCs uit de lamina propria van de volwassen muis darm geïntroduceerd om te bestuderen van de darmen gliale functie.
Aanhangend mesenterium en LMMP worden verwijderd met een wattenstaafje verwijdert enkele van de inter-myenteric-glia wonen tussen de lengterichting en spier, verhoogt de bereikbaarheid …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen erkennen steun van R37 DK045729 (naar JLM), R01 AR060837 (aan HX) en de Universiteit van Michigan gastro-intestinale Research Center moleculaire Core P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
Riferimenti
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
