Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto
Summary
Qui, descriviamo l’isolamento di cellule glial-enterico dal submucosa intestinale utilizzando le incubazioni EDTA sequenziale per chelare cationi bivalenti e quindi l’incubazione in soluzione di recupero delle cellule non-enzimatici. La sospensione cellulare risultante su poli-D-lisina e laminin di placcatura si traduce in una cultura altamente arricchita delle cellule glial submucosal per l’analisi funzionale.
Abstract
Il sistema nervoso enterico (ENS) è costituito da neuroni e cellule gliali enteriche (EGCs) che risiedono all’interno della parete del muscolo liscio, sottomucosa e della lamina propria. EGCs svolgono un ruolo importante nell’omeostasi dell’intestino attraverso il rilascio di vari fattori trofici e contribuire all’integrità della barriera epiteliale. Maggior parte degli studi delle culture primarie di gliale enteriche utilizzare cellule isolate dal plesso mioenterico dopo dissociazione enzimatica. Qui, un metodo non-enzimatici per isolare e cultura EGCs da submucosa intestinale e della lamina propria è descritto. Dopo la rimozione manuale dello strato muscolare longitudinale, EGCs furono liberati dalla lamina propria e sottomucosa utilizzando sequenziale incubazioni tamponata HEPES EDTA seguite da incubazione in soluzione di recupero di cella non enzimatici commercialmente disponibile. Le incubazioni di EDTA sono stati sufficienti per la maggior parte della mucosa epiteliale dalla lamina propria, permettendo la soluzione di recupero di cella liberare il EGCs submucosal della striscia. Qualsiasi residuo di lamina e muscolo liscio è stato scartato insieme glia myenteric. EGCs facilmente sono stati identificati dalla loro capacità di esprimere la proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Solo circa il 50% della sospensione delle cellule contenute cellule GFAP + dopo aver completato le incubazioni tessuto e prima della placcatura sul substrato di poli-D-lisina/laminin. Tuttavia, dopo 3 giorni di coltura le cellule in fattore neurotrophic derivato da cellule gliali (GDNF)-contenenti terreni di coltura, la popolazione delle cellule aderenti alle piastre rivestite con substrato composto da > 95% glia enterica. Abbiamo creato una linea di topo ibrido allevando un mouse hGFAP-Cre per la linea di reporter ROSA-tdTomato di monitorare la percentuale di cellule GFAP + usando la fluorescenza delle cellule endogene. Così, non-myenteric glia enterica può essere isolato dai metodi non-enzimatici e coltivata per almeno 5 giorni.
Introduction
Interesse per la funzione delle cellule gliali enteriche (EGCs) sono costantemente aumentata a causa del loro ruolo riconosciuto in intestino l’integrità e l’omeostasi1,2. Inoltre, EGCs variano in base alla loro posizione lungo la lunghezza del tratto GI3,4. EGCs rilasciare vari fattori trofici, compreso il fattore neurotrofico delle cellule gliali (GDNF), contribuiscono a sventrare motilità1,5 e rispondere a sottoprodotti microbici6,7. Gli studi hanno indicato che la popolazione di EGC è eterogenea e che la loro funzione varia a seconda che siano submucosal o risiedono all’interno del plesso mioenterico1,7. Ad esempio, EGCs all’interno del submucosa contribuiscono a giunzioni strette8. Espressione di GFAP e fosforilazione in EGCs differenziale sono stati collegati alla malattia di Parkinson, suggerendo loro possibile legame con il fenotipo di intestino di questo disordine9. Recentemente, è stato osservato che la perdita della proteina nucleare menin in culture isolate di EGCs da submucosa intestinale prossimale era sufficiente per indurre l’espressione dell’ormone gastrina10. Di conseguenza, è stato proposto che EGCs potrebbe essere l’origine dei gastrinomi duodenali, un tipo di tumore neuroendocrino10. Collettivamente, questi esempi sottolineano l’importanza di studiare il comportamento e la funzione di EGCs isolato in disturbi neuropatici e cancro11.
La sfida nel campo rimane come isolare e studiare uno o entrambi EGC popolazioni in vitro. Lignaggio traccia esperimenti hanno dimostrato che EGCs nel submucosa e della lamina propria provengono da cellule progenitrici nel plesso myenteric7. Anche se ci sono parecchi protocolli di isolamento pubblicati disponibili per generare colture di myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, nessuno è destinato in particolare isolamento della popolazione EGC submucosal/lamina propria. Protocolli esistenti per l’isolamento di EGC, in particolare, utilizzare una combinazione di separazione meccanica o il microdissection del muscolo liscio combinato con dissociazione enzimatica, scartando alla fine lo strato delle cellule della mucosa.
L’obiettivo di questo manoscritto è quello di illustrare i passaggi per isolare non-enzimatico primario EGCs da lamina propria per gli studi in vitro . Poiché non ci sono indicatori che specificamente distinguono myenteric EGCs da quelli nel submucosa, la separazione spaziale della mucosa epiteliale da muscolo liscio è stata sfruttata per isolare EGCs submucosal. Inoltre, combinando chelazione EDTA con dissociazione non enzimatica, EGCs sono stati isolati da sottomucosa in contrasto con il muscolo liscio, che è stato scartato insieme il EGCs inter-myenteric associato. Si è verificato ulteriore separazione della sottomucosa e della lamina propria EGCs coltivando le cellule glial cell-friendly substrati, ad es., poli-D-lisina e laminina.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs svolgono un ruolo importante nell’omeostasi dell’intestino, ed è essenziale per isolare e studiarle in vitro. In questo protocollo, un metodo semplice per l’isolamento di EGCs da lamina propria dell’intestino topo adulto è stata introdotta per studiare la funzione gliali enterico.
Rimuovendo il mesentere aderente e LMMP con un tampone di cotone rimuove alcune delle glia inter-myenteric che risiedono tra il muscolo longitudinale e circolare, aumenta l’accessibilità dei buffer a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere sostegno da DK045729 R37 (a JLM), AR060837 R01 (a HX) e l’Università del Michigan gastrointestinale Research Center molecolare Core P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
Riferimenti
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
