粘膜と粘膜固有層において大人のマウスから腸のグリア細胞の分離
Summary
ここでは、2価し、非酵素的細胞回復ソリューションのインキュベーションをキレート化するため逐次 EDTA 孵化を使用して腸の粘膜から腸溶性グリア細胞の分離について述べる。粘膜下のグリア細胞機能解析のための高濃縮培養結果ポリ-D-リジンおよびラミニンの結果細胞懸濁液をメッキします。
Abstract
腸神経系 (ENS) はニューロンと滑らかな筋肉壁、粘膜下層、粘膜固有層内に存在する腸溶性グリア細胞 (EGCs) から成っています。EGCs は様々 な栄養因子のリリースを通して腸内の恒常性に重要な役割を果たすし、上皮バリア性に貢献。プライマリ腸溶性グリア文化のほとんどの研究は、酵素分解後筋間神経叢から分離した細胞を使用します。ここでは、非酵素的メソッドを特定し、腸粘膜と粘膜から EGCs を文化を説明します。縦筋層を手動で削除後、EGCs は粘膜固有層と粘膜下組織シーケンシャル HEPES バッファー EDTA 孵化で市販の非酵素的細胞回復ソリューションを使用してから解放されました。EDTA の孵化した上皮粘膜から粘膜、粘膜下 EGCs を解放するためにセル回復ソリューションのほとんどを除去するのに十分です。残留粘膜と平滑筋は腸管グリアと共に破棄されます。EGCs はグリア線維性酸性蛋白 (GFAP) を表現する能力によって簡単に識別されました。細胞懸濁液の約 50% には、ティッシュの孵化を完了した後、ポリ-D-リジン/ラミニン基板上のめっき前に GFAP 陽性細胞が含まれています。ただし、グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF) で細胞を培養 3 日後-文化メディアを含む、基板コーティング プレートに付着した細胞集団から成る > 95% 腸溶性グリア。内因性細胞蛍光を用いた GFAP 陽性細胞の割合を記録するローザ ・ tdTomato 記者の行に hGFAP Cre マウスの繁殖によってハイブリッド マウス ラインを作った。したがって、非腸管腸溶性グリアを非酵素法によって分離、少なくとも 5 日間培養することができます。
Introduction
腸溶性グリア細胞 (EGCs) の機能に興味が腸の整合性と恒常性1,2で認識されている役割も増加します。また、EGCs は GI 管3,4の長さに沿っての場所によって異なります。EGCs グリア細胞由来神経栄養因子 (GDNF) を含む様々 な栄養因子をリリースでは、腸の運動1、5と微生物副産物6,7対応に貢献します。EGC 人口は異種とその機能は異なりますが粘膜または腸管神経叢1,7内に存在するかどうか、研究が示されています。たとえば、粘膜下組織内 EGCs はタイトジャンクショ8に貢献します。差分の GFAP 発現とリン酸化 EGCs では、パーキンソン病、この障害9腸形質への可能なリンクを示唆しているにリンクされています。最近では、近位小腸粘膜から EGCs の孤立した文化の核蛋白メニンの損失だったホルモン ガストリン10の発現を誘導するために十分なが観察されました。その結果、それは EGCs を十二指腸温存、神経内分泌腫瘍10種類の起源ことを提案しました。総称して、これらの例は、行動と神経因性疾患や癌の11分離 EGCs の機能研究の関連性を強調します。
フィールドでの挑戦を分離し、どちらかまたは両方 EGC 集団の in vitro研究方法のままです。リネージュ トレース実験は EGCs 粘膜と粘膜が腸管神経叢7の前駆細胞から起きることを示した。腸管 EGCs12,13,14,15,16,17の文化を生成可能ないくつかの公開された隔離のプロトコルがあるがあります 18,19, 粘膜下/板粘膜固有層 EGC 人口の分離を対象となし。EGC の分離のための既存のプロトコルは、機械分離の組み合わせや酵素分解、粘膜細胞層を最終的に破棄することと組み合わせる平滑筋のレーザーマイクロダイ セクションに具体的に使用します。
本稿の目的は、非酵素の in vitro研究粘膜からプライマリ EGCs を分離するための手順を示すことです。具体的には粘膜下組織から腸管 EGCs を区別するマーカーがないので平滑筋から上皮粘膜の空間的な分離は粘膜下 EGCs を分離する悪用されました。さらに、非酵素的解離と EDTA のキレート化を組み合わせることで、EGCs は関連付けられて間腸管 EGCs とともに破棄された平滑筋とは対照的粘膜下層から分離された.粘膜と粘膜 EGCs のそれ以上の分離は、グリア細胞向け基板、例えばポリ-D-リジンおよびラミニンの細胞を培養によって発生しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs は腸内の恒常性に重要な役割を果たすし、を分離し、体外研究が不可欠です。このプロトコルではアダルト マウス腸管の粘膜から EGCs を隔離するための簡単な方法は、腸溶性グリア機能を研究に導入されました。
綿棒で付着性腸間膜と LMMP を削除する縦走筋の間に存在する間腸管グリアのいくつかを削除します、粘膜表面にバッファーの利用可能性を高める?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者したい (JLM) に R37 DK045729 と (HX) を R01 AR060837、ミシガン州消化管研究センター分子コア P30 DK034933 の大学からのサポートを認めます。
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
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