Isolering av innstigning gliacellene fra Submucosa og Lamina Propria voksen museklikk
Summary
Her beskriver vi isolering av enteric-gliacellene fra intestinal submucosa bruke sekvensiell EDTA incubations for å chelate divalent kasjoner og inkubasjon i ikke-enzymatisk celle gjenopprettingsløsning. Kontaktflate resulterende celle suspensjon på poly-D-lysine og laminin resulterer i en høyanriket kultur av submucosal gliacellene for funksjonsanalyse.
Abstract
Innstigning nervesystemet (ENS) består av nevroner og enteric gliacellene (EGCs) som ligger i glatt muskel veggen, submucosa og lamina propria. EGCs spille en viktig rolle i tarmen homeostase gjennom utgivelsen av ulike trophic faktorer og bidra til integriteten til epithelial barrieren. De fleste studier av primære enteric glial kulturer bruke celler isolert fra myenteric plexus etter enzymatisk dissosiasjon. Her, er en ikke-enzymatisk metode for å isolere og kultur EGCs fra intestinal submucosa og lamina propria beskrevet. Etter manuell fjerning av langsgående muskel laget, ble EGCs frigjort fra lamina propria og submucosa med sekvensiell HEPES-bufret EDTA incubations etterfulgt av inkubasjon i kommersielt tilgjengelige ikke-enzymatisk celle gjenopprettingsløsning. EDTA-incubations var tilstrekkelig til å fjerne de fleste epithelial mucosa fra lamina propria, slik at cellen Gjenopprettingsløsningen å frigjøre de submucosal EGCs. Eventuelle gjenværende lamina propria og glatt muskel ble forkastet sammen med myenteric glia. EGCs var lett identifiseres av deres evne til å uttrykke glial fibrillary Sure protein (GFAP). Bare ca 50% av cellen suspensjon inneholdt GFAP + celler etter fullfører vev incubations og før plating på poly-D-lysin/laminin underlaget. Men etter 3 dager for dyrking cellene i glial celle-avledet nevrotropisk faktor (GDNF)-inneholder kultur medier, celle befolkningen følge substrat-belagt plater består av > 95% enteric glia. Vi laget en hybrid musen linje av avl hGFAP-grobunn musen til ROSA-tdTomato reporter linjen spore hvor stor prosentandel til GFAP + celler ved hjelp av endogene celle fluorescens. Dermed kan ikke-myenteric enteric glia, isolert av ikke-enzymatisk metoder og kultivert i minst 5 dager.
Introduction
Interesse i funksjonen for enteric gliacellene (EGCs) har stadig økt på grunn av deres anerkjente roller i tarmen integritet og homeostase1,2. I tillegg varierer EGCs plasseringen langs GI spor3,4. EGCs utgivelse ulike trophic faktorer inkludert glial celle-avledet nevrotropisk faktor (GDNF), bidra til å gut motilitet1,5 og svare på mikrobiell biprodukter6,7. Studier har indikert at befolkningen EGC er heterogene og at deres funksjon varierer avhengig av om de er submucosal eller bor innen myenteric plexus1,7. For eksempel bidrar EGCs i submucosa til tett veikryss8. Differensial GFAP uttrykk og fosforylering i EGCs har vært knyttet til Parkinsons sykdom, foreslå sine mulig kobling til tarmen fenotypen av denne uorden9. Nylig ble det observert at tapet av kjernefysiske protein menin i isolerte kulturer av EGCs fra den proksimale intestinal submucosa var tilstrekkelig til å indusere uttrykk av hormonet gastrin10. Som et resultat, ble det foreslått at EGCs kan være opprinnelsen til duodenalsår gastrinomas, en slags Nevroendokrine10. Samlet understreker disse eksemplene relevansen av studere atferd og funksjon av isolerte EGCs i nevropatisk lidelser og kreft11.
Utfordringen i feltet forblir isolere og studere en eller begge EGC populasjoner i vitro. Linjen spore eksperimenter har vist at EGCs i submucosa og lamina propria stammer fra progenitor celler i myenteric plexus7. Selv om det er flere publiserte isolasjon protokoller tilgjengelig å generere kulturer av myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, ingen mål spesifikt isolasjon av submucosal/lamina propria EGC befolkningen. Eksisterende protokoller EGC isolering bruker spesifikt en kombinasjon av mekanisk separasjon eller microdissection av den glatte muskulaturen kombinert med enzymatisk dissosiasjon, til slutt forkaster mucosal celle laget.
Målet med dette manuskriptet er å vise trinnene for å isolere ikke-enzymatisk primære EGCs fra lamina propria for i vitro studier. Siden det er ingen indikatorer som spesielt skiller myenteric EGCs fra de i submucosa, utnyttes romlige separasjon epithelial mucosa fra glatt muskel for å isolere submucosal EGCs. Dessuten, ved å kombinere EDTA chelation med ikke-enzymatisk dissosiasjon, ble EGCs isolert fra submucosa i motsetning til den glatte muskulaturen, som ble forkastet sammen med tilknyttede inter-myenteric-EGCs. Ytterligere separasjon av submucosa og lamina propria EGCs oppstod ved dyrking cellene i glial celle-vennlig underlag, f.eks poly-D-lysine og laminin.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs spille viktige roller i tarmen homeostase, og det er viktig å isolere og studere dem i vitro. I denne protokollen, ble en enkel metode for å isolere EGCs fra lamina propria av voksen mus tarmen introdusert for å studere enteric glial funksjon.
Fjerne tilhenger mesentery og LMMP med en bomullspinne fjerner noen av inter-myenteric glia ligger mellom langsgående og sirkulære muskelen, øker tilgjengeligheten av buffere til submucosal overflaten og fjerner mye av større kapill?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra R37 DK045729 (til JLM), R01 AR060837 (å HX) og University of Michigan Gastrointestinal Research Center molekylær Core P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
Riferimenti
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
