Изоляция кишечных глиальных клеток от подслизистой и Lamina Propria взрослых мыши
Summary
Здесь мы описываем изоляции кишечных глиальных клеток из кишечника подслизистой хелат двухвалентной катионов и затем инкубации в решение восстановления неферментативного ячейки с помощью последовательного инкубаций ЭДТА. Обшивка результирующая ячейка подвеска на поли D-лизин и Ламинин приводит высокообогащенного культуры подслизистую глиальных клеток для функционального анализа.
Abstract
Кишечные нервной системы (ENS) состоит из нейронов и кишечных глиальных клеток (EGCs), которые проживают в гладких мышц стенки, подслизистой и lamina propria. EGCs играют важную роль в кишечнике гомеостаза путем выпуска различных трофических факторов и способствовать целостности эпителиальных барьер. Большинство исследований первичных кишечных глиальных культур используют клетки изолированы от myenteric сплетения после ферментативные диссоциации. Здесь описан неферментативного метод, чтобы изолировать и культуры EGCs от кишечных подслизистой и lamina propria. После ручного удаления слоя продольных мышц EGCs были освобождены от lamina propria и подслизистой с помощью последовательного инкубаций HEPES-амортизированное ЭДТА, следуют инкубации в коммерчески доступных неферментативного клеток решение восстановления. ЭДТА инкубаций были достаточно, чтобы лишить большинство эпителия слизистой оболочки от lamina propria, что позволяет освободить подслизистую EGCs решение восстановления клеток. Любые остаточные lamina propria и гладких мышц была отвергнута наряду с myenteric глии. EGCs были легко определить по их способности выразить глиальных фибриллово кислой белка (СВМС). Только около 50% суспензию клеток содержится СВМС + клеток после завершения инкубаций тканей и до обшивки на поли D-лизин/Ламинин подложке. Однако, после 3 дней культивирования клеток в глиальных клеток нейротрофического фактора (GDNF)-содержащих Культура СМИ, популяции клеток, придерживаясь пластины с покрытием субстрат состоящий из > 95% кишечных глии. Мы создали гибрид мыши линию путем разведения hGFAP-Cre мыши к линии репортер Роза tdTomato отслеживать процент СВМС + клеток с использованием эндогенного клеток флуоресцентным. Таким образом не myenteric кишечных глии могут быть изолированы неферментативного методами и культивировали в течение 5 дней.
Introduction
Интерес к функции кишечных глиальных клеток (EGCs) неуклонно увеличивается из-за их признанной роли в кишечнике целостности и гомеостаза1,2. Кроме того EGCs варьируются в зависимости от их расположения вдоль тракта GI,3,,4. EGCs выпуска различных трофических факторов, включая глиальных клеток нейротрофического фактора (GDNF), способствовать кишки моторики1,5 и реагировать микробной субпродуктов6,7. Исследования показали, что население EGC неоднороден и что их функция варьируется в зависимости от подслизистую ли они находятся в пределах myenteric сплетения1,7. К примеру EGCs в подслизистой вклад плотных8. Дифференциальные СВМС выражение и фосфорилирования в EGCs были связаны с болезнью Паркинсона, предлагая их возможную связь с фенотипом кишки этого расстройства9. Недавно было отмечено, что потеря Менің ядерных белков в изолированных культур EGCs от проксимального отдела кишечника подслизистой было достаточно, чтобы побудить выражение гормон гастрин10. В результате было предложено, что EGCs может быть происхождение двенадцатиперстной кишки gastrinomas, тип нейроэндокринные опухоли10. В совокупности эти примеры подчеркивают актуальность изучения поведения и функции изолированных EGCs нейропатической расстройств и рака11.
Проблема в области остается как изолировать и изучить один или оба EGC населения в пробирке. Родословная трассировки эксперименты показали, что EGCs в подслизистой и lamina propria исходят из клеток-предшественников в myenteric сплетения7. Хотя есть несколько опубликованных изоляции протоколов, доступных для создания культуры myenteric EGCs12,13,14,,1516,17, 18,19, ни предназначается специально для изоляции подслизистую/lamina propria EGC населения. Существующие протоколы для изоляции EGC специально использовать сочетание механического разделения или microdissection гладких мышц, в сочетании с ферментативной диссоциации, в конечном итоге отбрасывая слоя слизистой оболочки клеток.
Цель этой рукописи заключается в демонстрации шаги не ферментативно изолировать первичной EGCs от lamina propria в vitro исследований. Поскольку Есть нет маркеров, которые специально отличить myenteric EGCs от тех в подслизистой, чтобы изолировать подслизистую EGCs эксплуатировался пространственное разделение эпителия слизистой оболочки от гладких мышц. В дополнение комбинируя ЭДТА Хелаты с неферментативного диссоциации, EGCs были изолированы от подслизистой в отличие от гладких мышц, которая была отвергнута наряду с EGCs связанные Интер myenteric. Дальнейшее разделение подслизистой и lamina propria EGCs происходило путем культивирования клеток на глиальных клеток friendly субстратов, например, поли D-лизин и Ламинин.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs играют важную роль в кишечнике гомеостаза, и важно, чтобы изолировать и изучить их в пробирке. В этом протоколе простой метод для изоляции EGCs от lamina propria кишки, Взрослый мышь была введена для исследования интестинальной глиальных функции.
Удаление адэрентных брыже…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить поддержку R37 DK045729 (чтобы JLM), R01 AR060837 (для HX) и в Университете Мичиган желудочно-исследовательский центр молекулярной Core P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
Riferimenti
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
