Isolering av enteriska gliaceller från Submucosa och Lamina Propria av vuxen musen
Summary
Här beskriver vi isolering av enteriska-glial celler från intestinal-submucosa använda sekventiell EDTA inkubationer för att kelat divalenta katjoner och sedan inkubation i icke-enzymatiska cell återställningslösning. Plätering resulterande cellsuspension på poly-D-lysin och laminin resulterar i en höganrikat kultur av submukösa gliaceller för funktionell analys.
Abstract
Det enteriska nervsystemet (ENS) består av nervceller och enteriska gliaceller (EGCs) som finns i glatt muskulatur väggen, submucosa och lamina propria. EGCs spelar viktiga roller i gut homeostas genom frisättning av olika trofiska faktorer och bidrar till den epiteliala barriären integritet. De flesta studier av primära enteriska gliaceller kulturer använder celler som isolerats från plexus myenteric efter enzymatisk dissociation. Här beskrivs en icke-enzymatisk metod att isolera och kultur EGCs från intestinal submucosa och lamina propria. Efter manuell borttagning av längsgående muskellagrar befriades EGCs från lamina propria och submucosa använder sekventiell HEPES-buffrat EDTA inkubationer följt av inkubation i kommersiellt tillgängliga icke-enzymatiska cell återställningslösning. De EDTA inkubationer var tillräckliga för att beröva de flesta av epitelial slemhinnan från lamina propria, så att cellen återhämtning lösningen att befria de submukösa EGCs. Eventuella kvarvarande lamina propria och glatt muskulatur var kasseras tillsammans med den myenteric glia. EGCs var lätt identifieras genom sin förmåga att uttrycka glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande). Endast omkring 50% av cellsuspensionen innehöll Fredsgenomförande + celler efter avslutad vävnad inkubationer och före plätering på poly-D-lysin/laminin substraten. Men efter 3 dagar att odla cellerna i glial cell neurotrofa faktorn (GDNF)-som innehåller kultur media, cell befolkningen följa substrat-belagda plattorna består av > 95% enteriska glia. Vi skapat en hybrid mus linje genom avel en hGFAP-Cre mus till raden ROSA-tdTomato reporter att spåra procentandelen Fredsgenomförande + celler med hjälp av endogena cell fluorescens. Således kan icke-myenteric enteriska glia vara isolerad av icke-enzymatiska metoder och odlade i minst 5 dagar.
Introduction
Intresset för funktionen av enteriska gliaceller (EGCs) har ökat stadigt på grund av deras erkända roller i gut integritet och homeostas1,2. Dessutom varierar EGCs enligt deras läge längs längden av GI-tarmkanalen3,4. EGCs release olika trofiska faktorer inklusive glial cell neurotrofa faktorn (GDNF), bidra till att tarmen motilitet1,5 och svara på mikrobiell biprodukter6,7. Studier har visat att EGC befolkningen är heterogena och att deras funktion varierar beroende på huruvida de submukösa eller uppehålla sig inom den myenteric plexus1,7. Till exempel bidra EGCs inom submucosa till åtsittande föreningspunkter8. Differentiell Fredsgenomförande uttryck och fosforylering i EGCs har kopplats till Parkinsons sjukdom, vilket tyder på deras möjlig länk till gut fenotypen av denna sjukdom9. Nyligen konstaterades att förlusten av den nukleära protein menin i isolerade kulturer av EGCs från proximala intestinal submucosa var tillräcklig för att framkalla uttryck av hormonet gastrin10. Därför föreslogs att EGCs kan vara ursprunget till duodenal gastrinomas, en typ av neuroendokrin tumör10. Sammantaget understreck dessa exempel relevansen av studera beteende och funktion av isolerade EGCs neuropatisk sjukdomar och cancer11.
Utmaningen i fältet är fortfarande hur man isolera och studera eller båda EGC populationer i vitro. Lineage trace experiment visat att EGCs i submucosa och lamina propria härrör från stamceller i myenteric plexus7. Även om det finns flera publicerade isolering protokoll tillgängliga att generera kulturer av myenteric EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, ingen specifikt riktar isolering av submukösa/lamina propria EGC befolkningen. Befintliga protokoll för EGC isolering använda specifikt en kombination av mekanisk separation eller lokalt av den glatta muskulaturen i kombination med enzymatisk dissociation, så småningom kasta det slemhinna celllagrar.
Målet med detta manuskript är att Visa stegen för att icke-enzymatiskt isolera primära EGCs från lamina propria för in vitro- studier. Eftersom det finns inga markörer som specifikt särskilja myenteric EGCs från i submucosa, var rumsliga separation av epitelial slemhinnan från den glatta muskulaturen utnyttjas för att isolera submukosala EGCs. Dessutom, genom att kombinera EDTA kelering med icke-enzymatiska dissociation, isolerades EGCs från submucosa i motsats till den glatta muskulaturen, vilket var kasseras tillsammans med de associerade inter-myenteric EGCs. Ytterligare separation av submucosa och lamina propria EGCs uppstod genom att odla cellerna på glial cell-vänlig substrat, t.ex., poly-D-lysin och laminin.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs spelar viktiga roller i gut homeostas, och det är viktigt att isolera och studera dem in vitro. I detta protokoll infördes en enkel metod för att isolera EGCs från lamina propria av vuxen mus tarmen för att studera enteriska gliaceller funktion.
Ta bort fastsittande krös och LMMP med en bomullspinne tar bort några av de inter-myenteric glia bosatta mellan längsgående och cirkulära muskeln, ökar tillgängligheten till buffertar till submukosala ytan och tar bort mycket …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill uppmärksamma stöd från R37 DK045729 (till JLM), R01 AR060837 (att HX) och University of Michigan Gastrointestinal forskning Center molekylär Core P30 DK034933.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
Riferimenti
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
