Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem
Summary
Burada, podosomes uyumlu bir filmde filmin topografik görüntülerin otomatik Analize hazırlanması uygulamak çıkıntı kuvvetleri değerlendirmek için kullanılan Deneysel teknikler ayrıntılı.
Abstract
Çok sayıda biyolojik bağlamlarda hayvan hücrelerinin fiziksel olarak mekanik Kuvvetleri geliştirerek onların çevre ile etkileşim gerekir. Bunlar arasında çekiş güçleri iyi karakterize olmuştur, ama teknikleri onların substrat uygun hücrelere tarafından sarf çıkıntı kuvvetler ölçümü izin veren bir eksikliği olduğunu. Biz onların yüzey üzerinde yapışık hücreleri tarafından sarf çıkıntı kuvvetleri ölçmek için deneysel bir kurulum tasarlanmıştır. Bu yüzey hücreleri uyumlu Formvar kağıt üzerinde kaplama deforme ve elde edilen topografya nanometre ölçeğinde atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarafından eşleştirilir. Kuvvet değerleri daha sonra protrusive hücresel yapılar geometri üzerinde dayalı deformasyon profil bir analiz ayıklanır. Bu nedenle, bir yaşam hücre bireysel çıkıntılı birimleri tarafından sarf kuvvetleri zamanla ölçülebilir. Bu teknik, kuvvet oluşturma ve çıkıntı içeren birçok hücresel süreçler, Yönetmelikte sağlayacaktır. Burada, insan makrofajlar tarafından kurulan podosomes tarafından oluşturulan protrusive kuvvetleri ölçmek için uygulama açıklar.
Introduction
Hayvan hücrelerinin fiziksel olarak matrix ve onların çevre1oluşturan diğer hücreleri ile etkileşim. Bu onlar için geçirme, cesetleri içselleştirmesi, dış bilgi edinme veya ayırt etmek gereklidir. Bu tür işlemlerde, mekanik Kuvvetleri hücre oluşturmak için gereken ve çok sayıda çalışma son yıllarda gösterdiği gibi kuvvetler oluşturmak ve çevresine yoklama için hücre yeteneği Örneğin nükleer silahların yayılmasına karşı yönlendiren biyolojik davranışını etkiler veya farklılaşma2,3. Buna karşılık, hücresel kuvvetler ölçümü kuvvet oluşturma Yönetmeliği çalışma ve onun dolaylı hücre davranış ve doku kader4,5anlamak için bir büyük yardımcısıdır.
Son yıllarda bir hücre üzerinde onun çevre6uygulamayın kuvvetleri ölçmek için yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde çok sayıda tanık olduk. Bunların çoğunluğu onlar mobil probları veya deforme substrat çekmek gibi hücreleri sarfetmek çekiş güçleri açığa vesile olmuştur. Ancak, mekanik Kuvvetleri çıkıntı hücre dışı ortama dahil ölçüm teknikleri bir eksikliği muzdarip ve iyi değil karakterize bugüne kadar.
Bu sınırlamayı aşmak için uygun belgili tanımlık substrate sarf kuvvetleri ölçmek için bir yöntem mevcut. Bu canlı hücreler hücreleri tarafından yüzey deformasyon ölçmek ve katılan kuvvetleri anlamak mümkün hale dik yönde deforme ince bir elastik levha üzerinde kaplama oluşur. Substrat topografya atomik kuvvet mikroskobu kullanarak nano çözünürlüğü ile ölçülür ve deformasyon kuvvetlerden değerlendirilmesi protrusive hücresel yapılar7,8, geometri bilgisine dayanıyor 9.
Burada, kurulum ve uygulama podosomes, protrusive yapışma yapıları için üç boyutlu ortamlarda10,11mezenkimal onların göç makrofajlar tarafından kurulan tarafından oluşturulan kuvvetleri ölçmek için açıklamak, 12,13,14,15,16,17. Bu teknik kuvvet oluşturma ve çıkıntı içeren birçok hücresel süreçler, Yönetmelikte anlayışı peşin olacak inanıyorum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malzeme özellikleri
Formvar, bizim durumumuzda deforme membran için malzeme seçimi birkaç şartları yerine getirmek gerekiyor. Malzeme için görünür ışık şeffaf olması ve gözlemler parlak alan ve floresan mikroskopi izin vermek için sınırlı otomatik floresans sergilemek gerekir. İnce film pürüzlülüğü de 10 olmalıdır nm açık hücre kaynaklı çıkıntılar gözlenmesi AFM görüntüleme tarafından izin veren ve hücre adezyon topografik herhangi bi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ilk katkılarından dolayı bu eser ve Matthieu Sanchez ve Françoise Viala için video filme ve düzenleme ile yardım için Anna Labernadie, Guillaume Charrière ve Patrick Delobelle için minnettarız. Bu eser l’Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planı kanser, Fondation Toulouse kanser ve insan sınır bilim programı (RGP0035/2016) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
Riferimenti
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Ricerca sul cancro. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
