Molekylær billeddannelse med matrix assisted laser desorption/Ionisation-baseret tænkelig massespektrometri (MALDI-IMS) tillader den samtidige kortlægning af flere analysander i biologiske prøver. Vi præsenterer her, en protokol til påvisning og visualisering af amyloid β protein på hjernen væv af Alzheimers sygdom og cerebral amyloid angiopathie prøver ved hjælp af MALDI-IMS.
Neuropatologiske af Alzheimers sygdom (AD) er kendetegnet ved ophobning og sammenlægning af amyloid β (Aβ) peptider i ekstracellulær plaques i hjernen. Aβ peptider, bestående af 40 aminosyrer, der genereres fra amyloid forløber protein (APP) af β – og γ-secretases. Aβ er deponeret i cerebral parenkym, men også i leptomeningeal og cerebral fartøj vægge, kendt som cerebral amyloid angiopathie (CAA). Mens en række Aβ peptider blev identificeret, detaljerede produktion og distribution af individuelle Aβ peptider i patologisk væv af AD og CAA har ikke været behandlet fuldt ud. Her, udvikler vi en protokol i matrix assisted laser desorption/Ionisation-baseret tænkelig massespektrometri (MALDI-IMS) på menneskelige obduktion hjernen væv at opnå omfattende protein kortlægning. Til dette formål, blev menneskelige kortikale prøver indhentet fra hjernen banken på Tokyo Metropolitan Institute i gerontologi. Frosne snit frosset organmateriale er skåret og overført til indium-tin-oxid (ITO)-belagt glas lysbilleder. Spectra er erhvervet ved hjælp af MALDI system med en rumlig opløsning op til 20 µm. Sinapinic syre (SA) lejrer ensartet på dias ved hjælp af enten en automatisk eller en manuel sprøjte. Med de nuværende tekniske fordele MALDI-IMS, kan en typisk data sæt af forskellige Aβ arter inden for de samme dele af menneskelige autopsied hjerner opnås uden specifikke prober. Desuden, høj opløsning (20 µm) billeddannelse af en annonce hjernen og svær CAA prøven viser tydeligt, at Aβ1-36 til Aβ1-41 blev deponeret i leptomeningeal fartøjer, mens Aβ1-42 og Aβ1-43 blev deponeret i cerebral parenkym som senil plaque (SP). Det er muligt at vedtage MALDI-IMS som en standard metode i kombination med kliniske, genetiske og patologiske observationer i forståelsen af patologi af annonce, CAA, og andre neurologiske sygdomme baseret på den nuværende strategi.
For at stille diagnosen og forstå patogenesen af neurodegenerative sygdomme, er præcise molekylære identifikation af patologiske indskud væsentlige1. I løbet af annonce, Aβ er produceret for at gøre enkeltbetalingsordningen i de cerebrale parenkym og deponeres i fartøjer længe før sygdom udbrud2,3,4,5,6. Mens Aβ1-42 er den fremherskende peptid i SP af annonce hjerner, andre Aβ varianter, som N-terminal eller C-terminale afkortet eller ændret Aβs, er også identificeret i berørte AD hjerner7,8,9, 10. Et fuldstændigt billede af den brede vifte af Aβ arter i menneskers hjerner, især med AD og cerebral amyloid angiopathie (CAA)11, vil hjælpe forskerne forstå Aβ produktion, stofskifte og deposition.
Som den klassiske tilgang af neuropatologiske, har Immunhistokemi (IHC) været den mest afgørende metode til at bestemme placeringen af Aβs i hjernen væv12,13,14,15. I almindelighed, IHC kan ikke skelne mellem molekyler når flere epitoper eksistere samtidigt. Derimod er en spirende massespektrometri-baseret proteom-analyse en værdifuld fremgangsmåde især til at analysere en bred vifte af Aβ arter i hjernen væv, som ikke kan differentieres med antistoffer16,17. Den konventionelle massespektrometri-baseret analyse af hjernen lysates og immuno-udfældet prøver ikke at afsløre mindre Aβ peptider og mister distributionsoplysninger af Aβ i hjernevæv.
I tidligere værker er visualisere Aβ indskud i mus hjerner lykkedes ved hjælp af transgene dyr model af annonce, for eksempel APP23. Denne proces skal dog stadig tekniske fremskridt at sammenligne IMS og IHC med hensyn til opløsning og følsomhed18,19,20. Annonce neuropatologiske bør undersøges på menneskers hjerner, og vi brugte MALDI-IMS teknologi på menneskelige obduktion hjernen væv for at opnå omfattende protein kortlægning21. Til dette formål udviklede vi en protokol til en avanceret type af massespektrometri, som har fordele i dens hurtighed, følsomhed og reproducerbarhed.
Her vi vist en detaljeret protokol og resultaterne af visualisering af Aβ og dens isoformer fra flere autopsied hjerner med annonce og CAA med MALDI-IMS. Profilen deposition af Aβs blev drastisk ændret fra Aβ1-42 til sin N – og C-terminale variationer. Aβ1-41 blev først identificeret og visualiseret i menneskers hjerner med den nuværende protokol og blev yderligere valideret med IHC21. I betragtning af at morfologi af deponerede Aβ af IMS med en høj opløsning analyse (20 μm) skal være i god aftale med IHC, bidrage IMS og IHC ligeledes til skelne Aβ indskud af deres placering og protein indhold, samt af deres morfologi. Som hele eksperimentet beskrevet her blev gennemført i occipital cortex, vil studerer lokalisering af forskellige arter, beta-amyloid på tværs af alle områder af hjernen være generaliseret med fremtidige eksperimenter ved hjælp af den aktuelle protokol.
Kritiske trin i protokollen er væv forberedelse skridt til at opnå en effektiv ionisering af aggregerede proteiner i human hjerne væv. En matrix lag er forpligtet til at absorbere laser energien og fremkalde desorption og ionisering af analysander. I denne proces, er en hele væv afsnit administrationsprocedurerne belagt med små krystaller. Homogen cocrystallization af analysand med matrix er afgørende for høj følsomhed og artefakt-fri imaging. Hver af de tre spray metoder har sine egne fordele. Manuel spray belægning er en af de hyppigst anvendte metoder. En airbrush er bekvemt; Det kræver dog dygtige operation. Nøjagtige og reproducerbare eksperimentel teknik er væsentlige, anbefales ved hjælp af en ultralyds sprøjten og/eller en automatisk sprøjte som beskrevet i de nuværende protokoller. Med hensyn til en ultralyd sprøjten, vil det ikke være påvirket af fugtighed og temperatur i rummet fordi det sprøjtes ind i et kammer. I mellemtiden, med en automatisk sprøjter, relativt konserveret rumlige opløsning med god reproducerbarhed er opnået. Generelt, den rumlige opløsning fremstillet med tre metoder stigning i størrelsesordenen 1) airbrush, 2) automatisk anordning og 3) ultralyd sprøjten.
Vigtigst, blev denne protokol oprindeligt oprettet for at opdage og visualisere Aβs i autopsied menneskehjerne prøver. Visualisering af Aβs med MALDI-IMS for APP23 mus, som er oprettet som en dyremodel af annonce baseret på svensk-type mutationen af menneskelige APP, har været rapporteret tidligere af andre med en eksisterende metode18,19. Den tidligere protokol anvendes til APP23 var imidlertid ikke tilstrækkelige til at visualisere Aβ i sin laterale opløsning og følsomhed. Tidligere værker drøftet, at høje Aβ koncentrationer uden det væv er klart artefakter i APP23 imaging med deres protokol18,19. Det betyder, at den såkaldte ‘sløre’ mellem virkelige SPs og IMS billeder på grund af matrix ekstraktionstrinet var uundgåeligt med MALDI-type billeddannelse. Men i den nuværende protokol, sløringen forsvandt og hvert spektrum repræsenteret hver enkelt SP i hjernen parenkym.
Som vist her, vi kan spore Aβ1-41 for første gang i annonce og CAA hjerner med MALDI-IMS samt med IHC, med et specifikt antistof i vores egen generation21. Ifølge modellens Aβ forarbejdning stammer Aβ1-38 fra Aβ1-45 via Aβ1-42, mens Aβ1-41 stammer fra Aβ1-45 af γ-secretase trinvis kavalergang27,28,29,30,31 . Det betyder, at den nuværende protokol understøtter denne model. Hvad angår begrænsningerne af denne teknik, skal vi overveje heterogenitet af prøver fra menneskelige obduktion hjernen. Den mest afgørende skridt i en vis forstand, er at vurdere kvalificeret obduktion hjernevæv med etiske bevis. Med den nuværende protokol om disse kvalificerede obduktion hjernen væv, kan MALDI-IMS individuelt spore hele fordelingen af de komplekse molekyler har flere ændringer samt ukendte faktorer regulering patogenesen af Annoncen, der endnu skal defineret. Desuden, i forståelsen af den overordnede patogenesen af forskellige neuropatologiske i alderen menneskelige hjerner, det skal være muligt at vedtage MALDI-IMS som en standard tilgang, i kombination med kliniske, genetiske og patologiske observationer i neurologiske sygdomme .
En anden kritisk trin MALDI-IMS er data mining proces fra de fremkomne data sæt, som altid er tidskrævende. Manuelle datamining af hver peak distribution kræver, at brugerne til at klikke gennem hvert billede og søger distributioner, som kan korrelere til morfologi for analyseret stikprøven. Automatisk rumlig opdeling kan bruges som det første trin i data mining, giver et overblik over datasættet og giver mulighed for hurtig påvisning af fremtrædende funktioner. I denne tilgang, lighederne mellem spektre i et givet område bestemmes statistisk og lignende spectra er grupperet i en klynge. Alle pixel farvekodes efter deres cluster tildeling (figur 5). I den nuværende annonce/CAA undersøgelse er området af interesse plads af Aβ depositioner i parenkymalt plak og de subaraknoidal og parenkymalt vaskulære strukturer. De to særprægede toppe, som blev yderligere bekræftet med IHC blev m/z-værdier fra Aβ1-40 og Aβ1-4221. Således, det er let at finde colocalized m/z med Aβ1-40 og Aβ1-42, som var allerede kommenteret til N – og C-terminale afkortet Aβ samt ukendt peptider, til yderligere analyse.
Weller og kolleger har rapporteret, at Aβ ophobes i fartøj vægge, mere omkring arterier end omkring vener21. Derudover er det blevet foreslået, at den interstitielle væske (ISF) omfatter Aβs udskilles fra den cerebrale parenkym til den lymfeknude via en perivascular dræning vej22,23,24,25 ,26. Den nuværende protokol til at generere en segmentering kort baseret på et MALDI-IMS datasæt på 20 µm beslutning støtter den mulige eksistens af perivascular dræning stier i hjernen (figur 5), som bidrager betydeligt til CAA i AD21 , 32. Desuden, vi kan opleve markør proteiner colocalized med plaque og subaraknoid Vaskulaturen ved at beregne korrelationen mellem hver m/z-værdier. For at forstå den samlede patogenesen af forskellige neuropatologiske i alderen menneskelige hjerner, skal det være muligt at vedtage MALDI-IMS som en kraftfuld tilgang i kombination med etablerede IHC data af kliniske, genetiske og patologiske observationer i neurologiske sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet i en del af licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (hjernen Protein aldring og demens kontrol 26117004; mi og TM). Denne forskning blev delvist støttet af det strategiske forskningsprogram for hjernen videnskaber fra Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED). Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne, der kommer.
Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
Scanner | EPSON | GT-980 | |
Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |