मैट्रिक्स के साथ आणविक इमेजिंग-असिस्टेड लेजर डिसॉलशन/आयनीकरण आधारित इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (माल्डी-आईएमएस) जैविक नमूनों में मल्टीपल एनालिटीज के एक साथ मानचित्रण की अनुमति देता है । यहां, हम पता लगाने और अल्जाइमर रोग और मस्तिष्क amyloid एंजियोपैथी के नमूने के ब्रेन ऊतकों पर amyloid β प्रोटीन के दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद माल्डी-आईएमएस का उपयोग कर ।
अल्जाइमर रोग के neuropathology (विज्ञापन) संचय और amyloid β (aβ) पेप्टाइड्स के एकत्रीकरण मस्तिष्क के extracellular पट्टिकायों में विशेषता है । अβ पेप्टाइड्स, ४० एमिनो एसिड से बना, amyloid अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) से β-और γ secretases से उत्पन्न कर रहे हैं । एβ न केवल सेरेब्रल पैरेन्काइमा में बल्कि लेप्टोमेनिंगयल और सेरेब्रल वाहिका दीवारों में भी जमा किया जाता है, जिसे सेरेब्रल एमीलॉयड एंजियोपैथी (CAA) के रूप में जाना जाता है । जबकि aβ पेप्टाइड्स की एक किस्म की पहचान की गई, विस्तृत उत्पादन और व्यक्तिगत aβ पेप्टाइड्स के रोग ऊतकों में विज्ञापन और CAA का वितरण पूरी तरह से संबोधित नहीं किया गया है. यहां, हम व्यापक प्रोटीन मानचित्रण प्राप्त करने के लिए मानव ऑटोप्सी मस्तिष्क के ऊतकों पर मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसॉलशन/आयनीकरण-आधारित इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (माल्डी-आईएमएस) का एक प्रोटोकॉल विकसित करते हैं । इस प्रयोजन के लिए, मानव cortical नमूनों मस्तिष्क बैंक से टोक्यो मेट्रोलॉजी के महानगरीय संस्थान में प्राप्त किया गया । जमे हुए cryosections कट और इंडियम-टिन-ऑक्साइड (आईटीओ) को हस्तांतरित कर रहे हैं-लेपित कांच स्लाइड । स्पेक्ट्रा 20 μm अप करने के लिए एक स्थानिक संकल्प के साथ माल्डी प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं । सिनापिनिक अम्ल (एसए) समान रूप से या तो एक स्वचालित या एक मैनुअल स्प्रेयर का उपयोग कर स्लाइड पर जमा किया जाता है । माल्डी-आईएमएस के वर्तमान तकनीकी लाभों के साथ, मानव autopsied दिमाग के एक ही वर्गों के भीतर विभिन्न aβ प्रजातियों में से एक ठेठ डेटा सेट विशिष्ट जांच के बिना प्राप्त किया जा सकता है । इसके अलावा, एक विज्ञापन मस्तिष्क और गंभीर CAA नमूना के उच्च संकल्प (20 μm) इमेजिंग स्पष्ट रूप से पता चलता है कि aβ 1-36 aβ 1-41 leptomeneal जहाजों में जमा किए गए थे, जबकि aβ 1-42 और aβ 1-43 सेरेन्काइमा सेनिले पट्टिका (SP) के रूप में जमा किए गए थे. यह वर्तमान रणनीति के आधार पर विज्ञापन, CAA, और अन्य स्नायविक रोगों की विकृति को समझने में नैदानिक, आनुवंशिक, और पैथोलॉजिकल टिप्पणियों के साथ संयोजन में एक मानक दृष्टिकोण के रूप में माल्डी-आईएमएस को अपनाना संभव है ।
निदान करने के लिए और न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के रोगजनन को समझने के लिए, पैथोलॉजिकल जमाव की सटीक आणविक पहचान आवश्यक है1। विज्ञापन के दौरान, एβ सेरेब्रल पैरेनकाइमा में एसपीएस बनाने के लिए उत्पादन किया जाता है और रोग शुरुआत2,3,4,5,6से पहले लंबे जहाजों में जमा होता है । जबकि aβ 1-42 विज्ञापन दिमाग के SP में प्रमुख पेप्टाइड है, अन्य aβ वेरिएंट, जैसे एन-टर्मिनल या सी-टर्मिनल छोटा या संशोधित aβs, भी प्रभावित विज्ञापन दिमाग में पहचान कर रहे हैं7,8,9, 10. मानव दिमाग में aβ प्रजातियों की व्यापक रेंज की एक पूरी तस्वीर, विशेष रूप से विज्ञापन और सेरेब्रल amyloid एंजियोपैथी के साथ (CAA)11, वैज्ञानिकों को aβ उत्पादन, चयापचय, और जमाव को समझने में मदद मिलेगी ।
neuropathology के शास्त्रीय दृष्टिकोण के रूप में, immunohistochemistry (ihc) मस्तिष्क के ऊतकों में aβs के स्थान का निर्धारण करने के लिए सबसे निर्णायक विधि किया गया है12,13,14,15. सामान्य तौर पर, ihc अणुओं भेद नहीं कर सकता जब कई epitopes एक साथ coexist. इसके विपरीत, एक उभरते मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित proteomic विश्लेषण विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों में aβ प्रजातियों की एक किस्म है, जो16,17एंटीबॉडी के साथ भेदभाव नहीं किया जा सकता का विश्लेषण करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है । मस्तिष्क lysates और immuno-उपजी नमूनों की पारंपरिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विश्लेषण मामूली aβ पेप्टाइड का पता लगाने के लिए विफल रहता है और मस्तिष्क के ऊतकों में aβ के वितरण की जानकारी खो देता है.
पहले काम करता है, में visualizing aβ माउस दिमाग में जमा किया गया है सफल विज्ञापन के एक ट्रांसजेनिक पशु मॉडल का उपयोग कर, जैसे APP23 । हालांकि, इस प्रक्रिया को अभी भी संकल्प और संवेदनशीलता18,19,20के संबंध में आईएमएस और ihc की तुलना करने के लिए तकनीकी प्रगति की जरूरत है । विज्ञापन neuropathology मानव दिमाग पर अध्ययन किया जाना चाहिए, और हम व्यापक प्रोटीन मानचित्रण21प्राप्त करने के लिए मानव शव मस्तिष्क के ऊतकों पर माल्डी आईएमएस प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया । इस प्रयोजन के लिए, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के एक उन्नत प्रकार है कि इसकी रैडिटी में लाभ है के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित, संवेदनशीलता, और पुनरुद्देश्यता.
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल और aβ के दृश्य के परिणाम और विज्ञापन और CAA के साथ कई autopsied दिमाग से अपने isoforms के परिणामों का प्रदर्शन माल्डी-आईएमएस के साथ । aβs की साठा प्रोफ़ाइल को अपने N-और C-टर्मिनल विविधताओं के लिए अβ 1-42 से काफी बदल दिया गया था । aβ 1-41 पहले की पहचान की और वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ मानव दिमाग में कल्पना था और आगे ihc21के साथ मान्य किया गया था. यह देखते हुए कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण (20 μm) के साथ आईएमएस द्वारा जमा किए गए अβ के आकारिकी को ihc, IMS और ihc के साथ अच्छे समझौते में होना चाहिए, समान रूप से उनके स्थान और प्रोटीन सामग्री, साथ ही साथ उनके आकारिकी द्वारा aβ जमा भेद करने में योगदान । के रूप में पूरे यहां वर्णित प्रयोग पश्चकपाल प्रांतस्था में आयोजित किया गया था, सभी मस्तिष्क क्षेत्रों में अलग बीटा amyloid प्रजातियों के स्थानीयकरण का अध्ययन वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर भविष्य के प्रयोगों के साथ सामांयीकृत किया जाएगा ।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम मानव मस्तिष्क के ऊतकों में एकत्रित प्रोटीन का एक प्रभावी आयनन प्राप्त करने के लिए ऊतक तैयारी कदम हैं । एक मैट्रिक्स परत के लिए लेजर ऊर्जा को अवशोषित और विशोषण और analytes के आयनन प्रेरित करने के लिए आवश्यक है । इस प्रक्रिया में, एक संपूर्ण ऊतक अनुभाग एक ही ढंग छोटे क्रिस्टल के साथ लेपित है । मैट्रिक्स के साथ analyte के समरूप coक्रिस्टलीकरण उच्च संवेदनशीलता और विरूपण साक्ष्य मुक्त इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है । तीन स्प्रे तरीकों में से प्रत्येक के अपने फायदे हैं । मैनुअल स्प्रे कोटिंग सबसे अक्सर इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है । एक एयरब्रश सुविधाजनक है; हालांकि, यह निपुण आपरेशन की आवश्यकता है । सटीक और पुनरुद्भूत प्रयोगात्मक तकनीक के रूप में आवश्यक है, एक अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर और/या वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एक स्वचालित स्प्रेयर का उपयोग करने की सिफारिश की है । एक अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर के संबंध में, यह कमरे के नमी और तापमान से प्रभावित नहीं होगा क्योंकि यह एक चैंबर में छिड़काव किया जाता है । इस बीच, एक स्वत: स्प्रेयर के साथ, अपेक्षाकृत अच्छा reproducibility के साथ स्थानिक संकल्प संरक्षित प्राप्त है । आम तौर पर, स्थानिक संकल्प के साथ प्राप्त तीन तरीकों में वृद्धि के क्रम में 1) airbrush, 2) स्वचालित डिवाइस, और 3) अल्ट्रासोनिक स्प्रेयर.
सबसे महत्वपूर्ण बात यह प्रोटोकॉल मूल रूप से मानव autopsied मस्तिष्क के नमूनों में aβs का पता लगाने और कल्पना करने के लिए उत्पन्न किया गया था. APP23 चूहों के लिए माल्डी-आईएमएस के साथ aβs के दृश्य, जो मानव अनुप्रयोग के स्वीडिश प्रकार उत्परिवर्तन के आधार पर विज्ञापन के एक पशु मॉडल के रूप में उत्पन्न होता है, एक मौजूदा विधि18,19के साथ दूसरों के द्वारा पहले सूचित किया गया है. हालांकि, पूर्व APP23 करने के लिए लागू प्रोटोकॉल अपने पार्श्व संकल्प और संवेदनशीलता में aβ कल्पना करने के लिए पर्याप्त नहीं था । पहले काम करता है कि ऊतक सीमा के बाहर उच्च aβ सांद्रता स्पष्ट रूप से उनके प्रोटोकॉल18,19के साथ APP23 इमेजिंग में कलाकृतियों की चर्चा की । इसका मतलब है कि तथाकथित ‘ धुंधला ‘ असली एसपीएस और आईएमएस मैट्रिक्स निष्कर्षण कदम के कारण छवियों के बीच माल्डी प्रकार इमेजिंग के साथ अपरिहार्य था । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल में, कलंक गायब हो गया और प्रत्येक स्पेक्ट्रम मस्तिष्क पैरेंकाइमा में हर एक सपा का प्रतिनिधित्व किया ।
जैसा कि यहाँ दिखाया गया है, हम पहली बार के लिए aβ 1-41 का पता लगा सकते हैं विज्ञापन और CAA दिमाग में माल्डी-आईएमएस, साथ ही साथ ihc के साथ, हमारी अपनी पीढ़ी के21द्वारा एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ. aβ प्रोसेसिंग मॉडल के अनुसार, aβ 1-38 aβ 1-45 के माध्यम से aβ 1-42 से व्युत्पन्न, जबकि aβ 1-41 से व्युत्पन्न aβ 1-45 द्वारा γ-secretase स्टेपवाइज क्लीवेज27,28,29,30,31 . इसका मतलब यह है कि वर्तमान प्रोटोकॉल इस मॉडल का समर्थन करता है । इस तकनीक की सीमाओं के लिए के रूप में, हम मानव शव मस्तिष्क से नमूनों की विविधता पर विचार करना चाहिए । सबसे महत्वपूर्ण कदम, एक अर्थ में, नैतिक सबूत के साथ योग्य शव मस्तिष्क ऊतक का आकलन करने के लिए है । उन योग्य शव मस्तिष्क के ऊतकों पर वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, माल्डी-आईएमएस व्यक्तिगत रूप से कई संशोधनों वाले जटिल अणुओं के पूरे वितरण को ट्रैक कर सकते हैं, साथ ही अज्ञात कारक (एस) विज्ञापन के रोगजनन को विनियमित करने के लिए, कि अभी तक कर रहे हैं परिभाषित. इसके अलावा, वृद्ध मानव दिमाग में विभिन्न न्यूरोपैथोलॉजी के समग्र रोगजनन को समझने में, एक मानक दृष्टिकोण के रूप में माल्डी-आईएमएस को अपनाने के लिए संभव होना चाहिए, नैदानिक, आनुवंशिक और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों में पैथोलॉजिकल टिप्पणियों के साथ संयोजन में .
माल्डी-आईएमएस का एक और महत्वपूर्ण कदम डेटा माइनिंग प्रोसेस प्राप्त डेटा सेट से है, जो हमेशा समय लेने वाला होता है । प्रत्येक चोटी के वितरण के मैनुअल डेटा खनन हर छवि के माध्यम से क्लिक करने के लिए उपयोगकर्ताओं की आवश्यकता है और वितरण कि विश्लेषण नमूना के आकारिकी के लिए सहसंबंधित हो सकता है के लिए देखो. स्वचालित स्थानिक विभाजन डेटा खनन के पहले कदम के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, डेटा सेट का एक सिंहावलोकन प्रदान करने और प्रमुख सुविधाओं का त्वरित पता लगाने की अनुमति. इस दृष्टिकोण में, किसी दिए गए क्षेत्र के स्पेक्ट्रा के बीच समानता सांख्यिकीय रूप से निर्धारित होती है, और इसी तरह स्पेक्ट्रा को एक क्लस्टर में समूहीकृत किया जाता है । सभी पिक्सल रंग अपने क्लस्टर असाइनमेंट (चित्रा 5) के अनुसार कोडित रहे हैं । वर्तमान विज्ञापन में/CAA अध्ययन, ब्याज क्षेत्र parenchymal पट्टिका और अवजालतनिका और parenchymal संवहनी संरचनाओं में aβ जमाव की जगह है । दो विशिष्ट चोटियों जो आगे आईएचसी के साथ मान्य थे, aβ 1-40 और aβ 1-4221से m/z मान थे । इस प्रकार, यह आसान है खोजने के लिए colocalized m/z के साथ aβ 1-40 और aβ 1-42 जो पहले से ही एनोटेटेड करने के लिए N-और C-टर्मिनल कटा हुआ aβ, साथ ही साथ अज्ञात पेप्टाइड्स, आगे के विश्लेषण के लिए.
weller और सहयोगियों ने बताया है कि aβ पोत दीवारों में जमा, नसों के आसपास की तुलना में अधिक धमनियों के आसपास21. इसके अलावा, यह प्रस्तावित किया गया है बीचवाला द्रव (isf) aβs मस्तिष्क पैरेंकाइमा से लिम्फ नोड के लिए उत्सर्जित एक परिसंवहनी जल निकासी मार्ग के माध्यम से शामिल22,23,24,25 ,26. वर्तमान प्रोटोकॉल एक विभाजन एक 20 μm संकल्प पर सेट एक माल्डी आईएमएस डेटा के आधार पर नक्शा उत्पंन करने के लिए मस्तिष्क के पेरिवास्कुलर जल निकासी रास्ते के संभावित अस्तित्व का समर्थन करता है (चित्रा 5), जो21 विज्ञापन में CAA करने के लिए महत्वपूर्ण योगदान , ३२. इसके अलावा, हम प्रत्येक एम/जेड मूल्यों के सहसंबंध की गणना करके प्लेक और सुब्राचनोइड वैक्लचर के साथ कोमार्ड मार्कर प्रोटीन की खोज कर सकते हैं । वृद्ध मानव दिमाग में विभिन्न न्यूरोपैथोलॉजी के समग्र रोगजनन को समझने में, यह नैदानिक, आनुवंशिक, और न्यूरोलॉजिकल टिप्पणियों के स्थापित ihc डेटा के साथ संयोजन में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में माल्डी आईएमएस को अपनाने के लिए संभव होना चाहिए रोगों.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के भाग में अनुदान द्वारा समर्थित था अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता में (मस्तिष्क प्रोटीन उंर बढ़ने और पागलपन नियंत्रण २६११७००४; करने के लिए M.I. और t.m.) । यह शोध आंशिक रूप से चिकित्सा अनुसंधान और विकास (एमएड) के लिए जापान एजेंसी से मस्तिष्क विज्ञान के लिए रणनीतिक अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था । सभी प्रयोग आने वाले दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे ।
Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
Scanner | EPSON | GT-980 | |
Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |