Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att undersöka prenylation och guanosin-5′-trifosfat (GTP)-lastning av Rho GTPase. Detta protokoll består av två detaljerade metoder, nämligen membran fraktionering och en GTPase-linked immunosorbent assay. Protokollet kan användas för att mäta prenylation och GTP lastning av olika andra små GTPases.
Abstract
Familjen Rho GTPase tillhör överfamiljen Ras och omfattar ca 20 medlemmar i människor. Rho GTPases är viktiga i regleringen av olika cellulära funktioner, såsom cytoskeletal dynamics, cell motilitet, cell polaritet, axonal vägledning, vesikulär människohandel och cellcykeln kontroll. Förändringar i Rho GTPase signalering spelar en viktig reglerande roll i många sjukdomstillstånd, såsom cancer, sjukdomar i centrala nervsystemet och immunförsvaret-beroende sjukdomar. Posttranslationell modifiering av Rho GTPases (dvs., prenylation av mevalonate väg intermediärer) och GTP bindande är viktiga faktorer som påverkar aktiveringen av detta protein. I detta papper finns två grundläggande och enkla metoder för att upptäcka ett brett utbud av Rho GTPase prenylation och GTP bindande aktiviteter. Uppgifter om de tekniska förfaranden som har använts förklaras steg för steg i detta manuskript.
Introduction
Rho GTPases är en grupp av små proteiner (21-25 kDa), som är väl bevarad i hela evolution, och bildar en unik underfamilj i Ras överfamiljen av små GTPases. I varje underfamilj inom denna superfamiljen finns det en delade G domän kärna som är inblandad i GTPase aktivitet och nukleotid exchange1. Skillnaden mellan familjen Rho och de andra Ras underfamiljerna är förekomsten av en ”Rho infoga domän” inom den 5: e β strand och 4th α helix i små GTPase domän2.
Baserat på den senaste klassificeringen, anses Rho GTPases en familj av proteiner som passar in i de Ras GTPase superfamiljen3-signalering. Däggdjur Rho GTPases har 22 medlemmar baserat på deras specifika funktion och allmän karakterisering4 där RhoA, Rac1 och Cdc42 är bland de mer studerade medlemmarna i denna grupp. Rho GTPases är kopplade till Intracellulär signalering vägar via en hårt reglerad mekanism som är beroende av molekylär växlar via protein posttranslationell ändringar5.
GTP lastning och hydrolys är grundläggande mekanismer i cykelns aktivering/avaktivering av små Rho GTPases och är reglerad via GTPase-aktiverande protein (luckor). Luckor är ansvarig för den GTP hydrolysisen och arbeta i samförstånd med guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs) som är ansvariga för GTP-lastning reaktionen. Rho BNP dissociation hämmare (GDIs) ge ytterligare reglering av små Rho GTPases via bindning till den BNP-bundna Rho GTPases. Detta hämmar BNP dissociation och underlättar komplexbildare av små Rho GTPases bort från de aktiva intracellulära membran platserna. Det finns också ytterligare reglering av Rho GTPase proteiner som innefattar de prenylation för GDIs som reglerar både nukleotid hydrolys och exchange och kontroller BNP/GTP cykling1,6,7,8.
Både GTP-lastning och Rho GTPase prenylation är involverade i rörelsen av Rho GTPase mellan cytosol och cellmembran genom att ändra dessa proteiner1,9lipofila egenskaper. Ovannämnda tillsynsmyndigheterna interagera med fosfolipider i cellmembranet och andra modulerande proteiner av BNP/GTP exchange aktivitet10. Dessutom blockerar GDIs, dissociation-hämmare, både den GTP hydrolysisen och BNP/GTP utbyte. GDIs hämmar dissociationen av de inaktiva Rho proteinerna från BNP och därmed deras interaktion med nedströms effektorer. GDIs reglerar också cyklingen av GTPases mellan cytosol och membranet i cellen. Aktiviteten av Rho GTPases beror till stor del på deras rörelse till cellmembranet; således anses GDIs kritiska regulatorer som kan binda GTPases i cytoplasman genom gömmer sin hydrofoba region/domäner11,12.
För Rho GTPase att ha en optimal signalering och funktion i alla stadier av dess aktivering cykel, är dynamisk cykeln av GTP-lastning/GTP hydrolysis avgörande. Någon form av förändringar i denna process kan leda till ändringar i cellfunktioner regleras av Rho GTPase, såsom cell polaritet, spridning, morfogenes, cytokines, migration, vidhäftning och överlevnad13,14.
Det nuvarande protokollet ger läsarna en detaljerad metod för att övervaka små RhoA GTPase aktiveringen via utredning av deras prenylation och BNP/GTP lastning. Denna metod kan också användas för att upptäcka prenylation och GTP bindningen av ett brett utbud av små GTPases. Den GTPase-linked immunosorbent assay kan användas för att mäta graden av aktivering av andra sorter av GTPases, såsom Rac1, Rac2, Rac3, H-, K- eller N-Ras, Arf och Rho15. Den farmakologiska agent simvastatin används som ett exempel, eftersom det var nyligen rapporterat att vara inblandade i regleringen av små Rho GTPase prenylation och aktivitet8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en noggrann metod för att mäta små GTPase prenylation och GTP bindande visas som små GTPase subcellulär lokalisering (membran kontra cytosol) och Rho GTP lastning. Små GTPases uttrycks i eukaryota celler och spela avgörande roller i cellulär proliferation, motilitet och struktur. Både prenylation och GTP bindande är involverade i regleringen av GTPase verksamhet. Därför är analyser att utvärdera prenylation och GTP bindningen av dessa proteiner viktiga verktyg för cell biologer<s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami stöddes av hälsa Science Centre löpande bidrag, CHRIM grant och Manitoba nya utredare löpande forskningsbidrag. Javad Alizadeh stöddes av forskning Manitoba STUDENTTILLVARO. Shahla Shojaei stöddes av Health Science Foundation löpande bidrag och den MITACS påskynda postdoktorsstipendium. Adel Rezaei Moghadam stöddes av en NSERC som löpande bidrag som hölls av Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki stöddes av NIH/NHLBI K08 tilldelning (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los vänligt bekräftar stödet från NCN bevilja #2016/21/B/NZ1/02812, stöds av LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (region Centre-Val de Loire, Frankrike) genom dess Smart Loire Valley allmänna Program och medfinansieras av Marie Sklodowska-Curie-åtgärderna, bevilja #665790. Simone da Silva Rosa stöddes av UMGF STUDENTTILLVARO.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
Riferimenti
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochimica. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The ‘invisible hand’: regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
