Summary
이 프로토콜에는 단편 장 허 혈의 돼지 모델을 성공적으로 설정 하 고 이후 격리 하 고 상피 수리 부상 다음의 연구에 대 한 장 줄기 세포 문화 독자 수 있게 됩니다.
Abstract
장 허 혈 병 적 상태 및 인간과 수의 환자에서 사망률의 주요 원인이 남아 있습니다. 많은 질병 과정 장 허 혈, 소장에 혈액 공급과 그러므로 산소 감소 때 발생할. 장 방 벽 손실 및 기본 조직에 손상이 리드. 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 기지에 있으며 항상성 그리고 다음 부상 하는 동안 장 갱신에 대 한 책임이 있습니다. 셀 문화 기술을 vivo ex 상피 줄기 세포 상호 작용의 성공적인 연구에 대 한 3 차원 상피 기관 같은 시스템의 성장을 지 원하는 문화 조건을 설정 하 여 허용 ("enteroids" 나 " colonoids"크고 작은 창 자에서 각각). 이러한 enteroids 크립 트와 모 같은 도메인으로 구성 되며 상피 내 세포 유형의 모든 포함 성숙. 역사적으로, murine 모델 장 부상 연구에 이용 되어 있다. 그러나, 돼지 모델의 크기 뿐 아니라 위장 해부학과 생리학의 인간을 포함 한 여러 가지 이점을 제공 합니다. 돼지 모델을 활용 하 여 우리는 단편 루프 장 허 혈의 단일 동물 내에서 만들 수 있습니다, 다른 연구 허 혈 성 손상의 시간 및 에 비보를 복구 하는 프로토콜을 설정 합니다. 또한, 우리 설명 소장의 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포 문화를 격리 하는 방법 줄기 세포에 의해 변조 상피 수리의 지속적인된 연구에 대 한 허용 비보 전.
Introduction
장 허 혈 성 손상, 감소 또는 소장에 혈액 흐름의 완전 한 폐색 감소 산소 가용성의 결과 병 적 상태와 사망률 인간과 동물 환자1,2의 중요 한 원인이 남아 있다. 연속적인 염증 및 세포 침투, 허 혈 성 손상, 점 막 장벽 타협 이끌어 낸다. 점 막 방 벽은 조직의 순환3,4로 세균성 전 좌와 관련 된 독 소의 예방에 중요 합니다. 허 혈 성 조직의 후속 reperfusion 상해5악화 수 있습니다 반응성 산소 종 손상의 형성에 발생할 수 있습니다. 장 허 혈 거의 예방 이기 때문에, 최신 연구는 국 소 빈 혈의 조기 발견 및 reperfusion 상해 또는 대상 점 막 복구를 줄일 수 있는 소설 치료 접근의 개발을 위한 기술 발전에 집중 했다.
동물 모델 국 소 빈 혈 reperfusion 상해의 우리의 기본적인 과학 지식을 확장 하 고 변환 연구에 대 한 필수 유지를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 설치류 모델 될 유전자 조작된6을 자신의 능력으로 인해 가장 널리 사용 되었습니다. 그러나 최근에, 큰 동물 모델, 특히 돼지의 사용 장점 인간7,8돼지 해 부와 생리 적인 유사성을 포함 하 여 수 미래 변환 연구 주장 되었습니다. 상해 모델의 다양 한 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 공부 하 고 완전 한 혈관 폐색, 단편 mesenteric 혈관 폐색, 낮은 흐름 허 혈 등을 개발 되었습니다. 그러나이 모델의 전체 리뷰 저자 최근 검토3독자 들을 직접이 문서의 영역 밖에 있다.
Vivo에서 모델 이외에 ex vivo 세포 배양 시스템의 사용 장 항상성 그리고 부상 다음 수리 공부를 유망한 도구를 제공 합니다. 장 줄기 세포는 세포 증식과 장내 상피 안 대기의 하는 일을 담당 합니다. 정상 또는 부상 창 자에서 분리, 장 줄기 세포 문화에서 유지 될 수 있다 고 도구 또는 줄기 세포와 상피 세포 생물학 공부 모델 역할. 격리 하 고 이러한 3 차원 설정 방법 문화 시스템 (enteroids 그리고 colonoids 각각 크고 작은 창 자에서 파생 된 경우 나) 다양 한 수 종과 기관 시스템9,10에 대 한 설명 ,11,,1213. 특히, 위 장관 내에서, 이러한 문화 시스템 모델 위장 질병 암, 병원 체 감염 및 염증 성 장 질환14를 포함 하 여에 사용 되었습니다. 이 시점에서 절연 및 어떤 종에서 ischemically 부상된 소장에서 장 줄기 세포의 유지 보수를 설명 보고 있다. 따라서, 우리가 여기 소설, 큰 동물 돼지 모델에서 재현 부상과의 추가 연구에 대 한 정상 및 ischemically 부상 창 자에서 장 줄기 세포를 분리 하는 기능 귀착되는 장의 허 혈의 과정을 설명 복구 전 비보입니다.
Protocol
이 실험에 대 한 모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 캐롤라이나 주립 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 문화에 대 한 준비
참고: 모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다. 특정 성장 인자 농도 표 1에 나열 됩니다.
- 이온을 제거 된 증류수 (ddH2O)에서 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션을 준비 합니다. 적절 하 게 혼합 하 고 NaOH 및 HCl 솔루션을 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 합니다.
참고: 각 실험 전에 신선한 EDTA 재고 솔루션을 확인 합니다. - 다음과 같이 분리 시 #1 (닥터 #1)를 준비 하 고 얼음에: 결합 인산 염 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + (PBS), 0.5 M EDTA, 1 M 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 µ M 없이 버퍼링 Y27632 및 1 X 항생제 Antimycotic 솔루션 (방지) 페니실린, 스, 암포 b를 포함 하
참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다. - 분리 시 #2 (박사 #2)를 다음과 같이 준비 하 고 37 ° C 물 목욕에: 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 0.5 M EDTA, 10 µ M 없이 결합 PBS Y27632 및 1 X 방지. 참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다.
- 장 상피 줄기 세포 (IESC) 미디어를 다음과 같이 준비: 믹스 25 mL 고급 1 X n 2 보충과 DMEM/F12 매체, 1 X B-27 보충, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax 및 1 X 방지. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다.
- 다음과 같이 감소 된 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 (matrix) 및 보충 성장 요인의 마스터 믹스를 준비: 얼음에 매트릭스를 녹여. Microcentrifuge 튜브에서 100 ng/mL을 추가 재조합 인간 머리, 500 ng/mL 재조합 인간 R-Spondin 1, 50 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 100 ng/mL 재조합 인간 Wnt3a, 10mm 니코틴, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µ M Y-27632 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 및 2.5의 글 리 코겐 synthase 키 니 아 제 3 억제제 (GSK3i, CHIR99021). 매트릭스를 해 동 때 성장 인자 믹스 (믹스 마스터 만들기)와 함께 보충 하 고 얼음에 저장.
참고: 도금 동안 매트릭스 패티 내 유물을 만들 것이 공기 방울을 소개 하지 않도록 주의 해야 합니다. - 미리 따뜻하게 세포 격리 절차를 시작 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 24-잘 조직 문화 접시.
2. 수술 모델 허 혈 및 조직의 컬렉션의
- 8 10 주 오래 된 요크 셔를 사용 하 여 잡종 돼지 중 섹스 (권장). 수술 전에 모든 피드 16-18 h를 제거 합니다. 돼지 물이 항상 액세스를 허용 합니다.
- 예약 도착 돼지 환경 새 환경 순응 수 있도록 실험 하기 전에 적어도 48 h.
참고: 허용한 수 의사에 의해 감독 하는 훈련 된 동물 및 실험실 기술자 일상적인 동물 보호와 마 취 절차와 지원을 제공 합니다. - Premedicate xylazine와 돼지 (1.5 mg/kg 피하 (IM))와 케 타 민 (11-20 mg/kg (IM))15. 일단 진정, 넣어야 돼지 orotracheally.
- 안락사의 시간까지 100% O2 에 증발 isoflurane (2-5%)와 일반 마 취 돼지를 유지 합니다.
- 정 맥 (IV) 카 테 터 (권장 귀 정 맥)을 놓고 15 mL/kg의 유지 속도로 lactated ringers 솔루션 등 교체 유체 관리/h.
- 마 취 펄스 프로브가, 심전도 및 간접 혈압 측정15를 포함 하 여 모니터링 루틴을 수행 합니다. 돼지의 호흡 속도 노력을 모니터링 하 고 수동으로 또는 끝 갯벌 공동2 55-60 mmHg 이상으로 상승 하는 경우 필요에 따라 기계적으로 환기.
참고: 적절 한 마 취 심장 박동 (범위 80-130 비트/분), 비-침략 적 혈액 압력 (평균 동맥 압력 75-100 mmHg), 호흡 속도 (10 월 25 일 호흡/min)16, 및 정기 검사 동향의 지속적인 모니터링에 의해 확인 된다 대 한 턱과 항문 톤의 부재. 마 취의 깊이 또한 근육 이완과 근육 fasciculation 다음 수술 자극의 정도 의해 재판 될 수 있습니다. 눈 반사는 일반적으로 아무 값16의. 진통 기관 IACUC 정책 지시에 따라 제공 될 수 있다. 이 경우에 opioid buprenorphine, 같은 수술 중 시행 수 있습니다. - 생리대에 돼지를 놓고 수술에 대 한 지 느 러 미 recumbency에서 억제 합니다.
- 복 부 복 부를 면도 하 고 수술 스크럽 (액체 솔루션)과 이소프로필 알코올을 사용 하 여 준비.
- 복 부에 액세스 하는 배꼽 중심으로 메스 블레이드를 사용 하는 8-10-cm 복 부 정중 선 절 개를 확인 합니다.
- 작은 창 자 (공장) 약 40 cm 구두 ileocecal 연결을 식별 합니다. 원주 창 두 번 ligating에 의해 공장의 10 cm 긴 루프 윤곽을 그리 다, 후속 만들기 전에 각 합자 한 cm 루프 10 cm 구두 위치 (그림 1).
- 만들 허 혈의 시간 포인트 당 2 개의 루프에 인접 한 다른 국 소 빈 혈과 허 혈에 대 한 하나 하나 reperfusion의 추가 1 시간 원하는 경우. 완전 한 국 소 빈 혈 동맥 또는 정 맥 (흐름)를 만들려면 클램프 또는 mesenteric 맥 관 구조 1, 2, 3, 및 4 h에 대 한 불독 혈관 클램프, 곡선된 테드 모기 hemostats, 또는 2-0 비 흡수 실크를 사용 하 여 선 한 다음 제거를의 1 시간에 대 한 클램프 reperfusion, 원하는 경우
참고: 저자 허 혈의 모든 루프 4 h 허 혈 성 루프 시작 순서로 만들어지고 proximally (최소화 하기 위해 전체 수술 시간) 이동 진행. 해결 하기 위해 허 혈 성 장 세그먼트 이웃 인접 루프를 손상 될 수 있습니다 가능성, 허 혈 성 루프의 다양 한 수 있습니다. 이 전체 수술 시간을 변경할 수 있습니다.
참고: reperfusion 시간 프레임 수 있을 다양 한 관심 또는 치료 reperfusion 기간 동안 테스트 하고자 하는 경우의 연구 문제에 따라. 그러나, 혼자 허 혈의 기간을 증가에서 더 심각한 조직 손상 되면서 reperfusion 상해 가능성이 더 상피 부상에 공헌 하지 않는다. Reperfusion 허 혈 성 손상의 가벼운 기간을 다음 역할을 담당할 가능성이 않습니다. - 허 혈 시간 점 사이 복 부 커버 또는 메 마른 수건 또는 수건 클램프를 사용 하 여 폐쇄 유지.
참고:이 실험에 대 한 단일 동물, 이내 8 허 혈 성 세그먼트 만들 수 있습니다. 적어도 5-10 cm는 내부 일반 컨트롤 역할을 하, 마지막 허 혈 성 루프 인접 한 추가 jejunal 세그먼트를 식별 합니다. - 불독 혈관 클램프 또는 곡선된 테드 모기 hemostat 당 약 3 개의 mesenteric 배를 방해. 해야 합니다 주의 hemostat 응용 프로그램 동안 혈관은 쉽게 충격 때문에. 클램프의 문 턱에서 용기를 스택 하려고 합니다.
- 실험, 다음 안락사 pentobarbital 85-100 mg/kg iv,의 끝에 하트 비트 auscultated 및 각 막 반사의 손실 없이 죽음 확인 된 후 metzenbaum가 위를 사용 하 여 조직의 모든 루프를 수집 합니다. 마지막으로 허 혈 성 루프에 인접 정상 공장 적어도 5-10 cm의 제어 부분을 수집 하 여 시작 합니다.
- 하 고 토 굴 격리에 대 한 준비까지 얼음 차가운 PBS의 작은 용기에 각 상해 시간 지점에서 루프를 저장 합니다.
참고: 원하는 경우, 허 혈 성 게 루프 충분히 조직학 및 장 줄기 세포 배양에 대 한 별도 샘플으로 분할 하 그러나, 저자는 보다 큰 대략 10 cm 긴 루프는 대부분 출혈 될 가능성이 발견 했다.
3. 암호 (줄기 세포) 격리에서 허 혈 성 및 제어 루프
- 소장 점 막 표면 노출 20 게이지 와이어 및 조직 집게를 사용 하 여의 각 루프 반전. 와이어 봉합 사 (2-0 비 흡수 실크 또는 동등 물)를 사용 하 여 안전 하 게 루프의 위아래를 묶어.
- 반전, 다음 얼음 차가운 PBS luminal 파편 제거 하에서 각 루프를 씻어.
- 30 분 동안 얼음에 닥터 # 1 50 mL 원뿔 튜브로 즉시 샘플을 놓습니다.
- 수집 제어 시작 루프와 허 혈의 기간을 점진적으로 증가의 루프 함께 하십시오. 덜 손상 된 조직 (즉, 제어 및 1 시간 허 혈 성 조직)에서 루프는 강제로, 최상의 결과 위해 손목 스냅 동요 될 수 있다. 심각 하 게 손상 된 조직 (국 소 빈 혈의 3, 4 h)에서 조직 해야 부드럽게 누 볐 어 하거나 거꾸로 토 굴 중단 및 추가 조직 파괴 하면 너무 많이 떨고 하는 때에. 튜브는 동요 하거나 얼음을 하는 동안에 매 5 분을 거꾸로 해야 합니다.
- 37 ° C 물 탕에서 10 분 박사 # 2로 샘플을 전송. 흔들어 또는 반전 튜브 마다 5 분.
- 조직 전송 후 원심 원뿔 관 표면에 뜨는 EDTA를 제거 하려면 2-4 h 손상 루프에서 닥터 # 1를 포함 된 (200 x g 5 분). 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 이미 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행.
- 박사 # 2에서 샘플을 제거 하 고 얼음 (라벨 세척 # 1)에서 차가운 PBS의 25 mL에 직접 조직 샘플을 배치. 60 rpm에서 얼음에 궤도 셰이 커에 샘플을 놓습니다. 흔들어 또는 반전 30 각 튜브를 계속 s 마다 2 ~ 5 분.
- 원뿔 관 2-4 h에서 박사 # 2를 포함 하는 조직, 스핀 전송 후 표면에 뜨는 EDTA (200 x g 5 분)을 제거 하는 루프를 손상 된. 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행.
- 50 µ L 약 수 또는에서 제거 세척 #1 (DR) 토 굴 분리의 정도 및 파편의 양을 확인 하기. 새로운 50 mL 원뿔 관으로 조직 배치 (워시 #2, #3, 등) 그대로 지하실 최소한의 파편과 villi 격리 될 때까지 차가운 PBS와 쉐이크의 25 mL로 가득.
참고: 목표는 그대로 지하실 및 최소한의 파편 한 깨끗 한 부분을 수 있을 것입니다. 그러나 각 추가 세척 보조 조직/세포 손상에 시작 됩니다 너무 떨고 세포를 청소 합니다. 또한, 최소 오염 된 최상의 결과 세척 단계와 분리 시 약 단계에서 아닙니다 지하실은 도금 하는 경우 달성 될 것입니다. - 남아 있는 조직을 제거 하 고 상쾌한, 제거에 5 분 동안 200 x g에서 50 mL 원뿔 튜브 원심 다음 PBS (5 mL)의 작은 볼륨에 남아 있는 토 굴 펠 릿 resuspend.
- 거꾸로 현미경을 사용 하 여, 지하실/분수의 수를 결정 하기 위해 각 샘플의 50 µ L aliquots를 검사 합니다. 목표는 50-100 지하실/50 µ L,이 최종 매트릭스 버거의 크기를 될 것입니다.
참고: 샘플은 너무 집중 하 고, 계속 해 서 원하는 농도 도달할 때까지 차가운 PBS를 추가. 샘플 너무 희석 이면 원하는 암호 수익률에 도달 하 고 조정 하는 데 필요한 aliquots의 수를 결정 합니다. - Microcentrifuge 튜브로 (aliquot 관측에 의해 결정 되는) 지하실의 적절 한 볼륨을 aliquot. 예를 들어 샘플 포함 50 지하실/50 µ L 다음 패티 X 3 복제 당 aliquot 50 µ L = 150 µ L / microcentrifuge 관. 샘플만 포함 25 지하실/50 µ L 다음 필요한 2 aliquots / 패티 X 3 복제 하는 경우 = 300 µ L/튜브.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g에서 펠 릿 지하실
- 부드럽게 수송과 지하실 마스터 믹스 (잘 당 50 µ L)의 적절 한 볼륨으로 resuspend. 빠르게 공기 거품을 만들지 않고 15 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
참고: 사전 발음 마스터 믹스 이전에 찬 메 마른 PBS 가진 피 펫 팁 멋진. 이 밖으로 확산 마스터 믹스를 유지 도움이 됩니다. 팁 또한 냉장고에 보관 하 고 즉시 사용 하기 전에 후드에 배치 수 있습니다. - 미리 데워 진된 24 잘 플레이트의 각 우물의 센터에 50 µ L 마스터 믹스 플러스 토 굴 방울을 분배.
- 37 ° c.에 30 분 동안 문화 접시를 품 어
- 500 µ L / IESC 미디어 (없음 추가 성장 요인으로 그들은 마스터 믹스에 포함 된 0에 필요한)의 각 매트릭스 패티를 오버레이 합니다.
- 습도 유지 하기 위해 접시에 어떤 사용 되지 않는 우물에 500 µ L 살 균 PBS를 추가 합니다.
- 0을 도금된 지하실의 수를 계산 합니다.
참고: 각 셀 더 정확 하 게 계산 될 수 있도록 사분면으로 격판덮개 문화 사전 격자에 도움이 됩니다. - Enterospheres 모든 24 h의 수를 계산 하 고 매일 enteroid 개발에 대 한 모니터링 합니다.
- 각 잘 모든 48 헤에 성장 인자 IESC 미디어 모든 96 h 제거와 500 µ L 신선한 미디어 (성장 인자 다음에 추가 되어야 합니다 미디어) 바꿉니다 추가 합니다.
Representative Results
완전 한 장의 허 혈 봉합 또는 클램프 그림 1에서 보듯이 혈관 폐색을 이용 하 여 작은 창 자 루프에서 만들었습니다. 클램프를 방출 하 여 reperfusion의 제어 기간 수행할 수 있습니다, 필요한 경우 후속 reperfusion 상해의 추가 연구에 대 한 허용. 모든 동물 안락사까지 최소한의 합병증과 절차 동안 살아남았다. 가장 일반적인 수술 합병증 저 혈압, dobutamine 등 긍정적인 inotrope의 보완으로 해결 했다.
제대로 수행 하는 경우 허 혈 성 부상 장 모의 끝에 시작 하 고 아래로 크립 내 허 혈 증가 (그림 2)의 기간으로 마이그레이션할. 수술 방법으로 하나의 일반적인 실수 때 혈관 출혈 하거나 균등 하 게 채워 하지 발생할 수 있습니다. 결과 출혈 성 허 혈 (그림 3), 얇은-벽으로 정 맥이 동맥, 추가 혈액 조직 침투를 허용 하기 전에 축소 하는 이다. 이것은 어두운 자주색 serosal 표면으로 (그림 3, 왼쪽) 완전 한 국 소 빈 혈 (그림 3, 오른쪽) 동안 더 창백한 표면에 비해 심하게 보인다.
허 혈 성 장 루프의 제거, 다음 장 지하실 분리 프로토콜 (그림 4)를 다음 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 timepoints에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 프로토콜, 동안 심각 하 게 부상된 창 자 기본 조직에 추가 손상을 방지 하기 위해 부드럽게 동요 될 해야 합니다. 떨고 너무 대략 더 크립 트 손상과 EDTA, 추가 붕괴의 결과 포함 하는 DR 솔루션에서 끝나는 지하실의 대부분에서 발생할 수 있습니다.
일단 도금, 국 소 빈 혈의 모든 시간 지점에서 지하실 생존과 문화 (그림 5)에 설립 될 수 있습니다. 문화에서 정상적이 고 약간 손상 된 장 지하실은 도금 하는 때, 24-48 시간 이내 enterospheres 형태. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 장 지하실 생존 하지만, 처음 훨씬 더 작은 분야의 형성의 결과로 손상 된. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 전반적으로, 지하실의 감소 성장 효율 뿐만 아니라 심각 하 게 손상된 된 장의 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017)에서 파생 된 enteroids의 감소 크기입니다.
그림 1 : 돼지 모델에서 완전 한 장의 허 혈의 수술 모델. Exteriorized A) 정상적인 돼지 공장입니다. B) mesenteric 혈관 봉합 만드는 장 국 소 빈 혈과 출혈 되어 있다. C) 허 혈 원하는 경우 조직 reperfusion 있도록 불독 혈관 클램프를 사용 하 여 만든. D) 장의 맥 관 구조 직후 혈관 클램프의 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 완전 한 장의 허 혈의 더 긴 기간을 따라 상피 손상을 증가의 더 증거 (hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩). 손상의 끝에 모 단일 셀 상피 층, 모 blunting 및 세포 손상 심한 부상 (최대 4 h 기간) 기본 토 굴 아래로 연장의 점차적인 손실 시작 합니다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 심한 출혈 성 허 혈의 더 증거. A) 총 사진 출혈 국 소 빈 혈 (왼쪽된 루프)와 완전 한 국 소 빈 혈 (오른쪽 루프) 비교. 맥 관 구조 출혈 또는 균등 하 게 채워, 혈액 추가 염증 및 손상의 결과로 조직에 침투 하기 위해 계속 수 있습니다. 1-4 h에서 기간 증가의 출혈 성 허 혈의 B) H & E 이미지. 세포 손상을 완전 한 국 소 빈 혈으로 본, 뿐만 아니라 주변 lamina propria 내 적혈구 침투의 증거가 있다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 허 혈 성 및 정상적인 내장의 루프에서 격리 장 지하실의 aliquots. 완전 한, 그대로 장 지하실 (별표) 내장의 각 루프에서 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 시간 지점에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 격리 소장의 허 혈 성 루프에서 다음 장 줄기 세포 성장의 시간 과정. 정상적인 장 지하실 문화에 도금 했다, enterospheres 24-48 시간 이내에 형성. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 지하실 생존 하지만 처음 훨씬 더 작은 구체를 형성. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 20 µ m 규모 언급 하지 않는 한 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 성장 인자 | 희석제 | 사진 농도 | 재고 희석 | 작업 희석 |
| R-Spondin | PBS | 100 X | 100 µ g/ml | 1 µ g/ml |
| 머리 | SW/0.1%BSA | 1000 X | 100 µ g/ml | 100 ng/ml |
| EGF | 10 mM 아세트산 | 10000 X | 500 µ g/ml | 50 ng/ml |
| A-83-01 | DMSO | 1000 X | 500 Μ M | 500 nM |
| SB202190 | DMSO | 3000 X | 30 mM | 10 Μ M |
| 니코틴 | 소프트웨어 | 1000 X | 1 M | 1mm |
| Gastrin | PBS | 10000 X | 100 Μ M | 10 nM |
| Y-27632 | PBS | 1000 X | 10 m m | 10 Μ M |
| LY2157299 | DMSO | 10000 X | 5 mM | 0.5 Μ M |
| CHIR99021 | PBS | 1000 X | 2.5 m m | 2.5 Μ M |
| Wnt3a | PBS | 2000 X | 200 µ g/ml | 100 ng/ml |
표 1: 성장 인자 시 테이블. 성장 인자 재고 솔루션 및이 프로토콜에 사용 되는 작업 솔루션의 요약.
Discussion
단편 장 허 혈의 돼지 모델의 개발 같은 동물 내 조직 상해의 여러 시간 점의 연구 함으로써 이전 murine 모델에 따라 확장 합니다. 적절 한 혈관 결 찰, 성공적인 암호 세포 배양, 조직 reperfusion 등이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 논의 점 있다.
적절 한 혈관 결 찰 완전 한 국 소 빈 혈의 모델의 생성에 필수적 이다. 봉합 균등 하 게 연결 또는 클램프 하지 완전히, 혈액에서 강화 두꺼운 동맥 조직 입력을 계속 수 있습니다 고 얇은 벽 정 맥 붕괴 때문 종료 수 없습니다. 추가 조직 손상을 일으키는 lamina propria에 혈액의 넘쳐 흐름 발생 합니다. 그러나, 공부 되 고 허 혈 성 손상의 유형에 따라 전체 또는 출혈 성 허 혈을 원하는 수 있습니다. 예를 들어 장 이식 과정에서 창 완전히 분리 절차를 완전 한 장의 허 혈의 절제 단계 혈관 공급 (동맥 및 정 맥)에서. 그러나 또는,,는 mesentery 장 volvulus 같은 이벤트 동안 트위스트는 때 정 맥 반환은 종종 방해 먼저 동맥 공급 되 고 전에 조직 내에서 추가 혈액을 선도 하는 방해, 따라서 만들기 출혈 성 허 혈입니다.
허 혈 성 손상 모 끝에 시작 하 고 토 굴3의 기지까지 확장 조직의 손상을 발생 합니다. 허 혈, 중 아데노신 3 인산 염의 형태로 에너지 사용을 계속 하 고 대사 산물 hypoxanthine를 생성 합니다. 조직이 산소와 reperfused는, hypoxanthine 세 산화 효소에 의해 대사 되 고 점 막 상해 및 조직 손상 호 중구17,18의 초과 자유 래 디 칼 생성. 다양 한 표현의 세 산화 효소, 점 막 혈관 구조에 종 차이 reperfusion 상해3의 다양 한 각도 귀 착될. 국 소 빈 혈 reperfusion의 고양이 쥐 모델은 반응성 산소 대사 산물19,20에서 reperfusion 상해에 더 취약. 반면에, 돼지 더 적은 세 산화 효소와 따라서 적은 reperfusion 상해, 인간의 장 허 혈21의 더 비교이 모델을 만드는을 발견 했다. 이 시점에서 녹아웃 또는 장 부상 공부 유전자 변형 돼지 모델의 사용은 하지 설명,이이 모델의 주요 한계를 만들기. 질병 과정에 따라 적절 한 동물 모델의 선택 또는 특정 조건 연구원 공부 하고자 합니다. 예를 들어 h 6까지 허 혈 성 손상의 돼지 모델 되었습니다 설명된22, 반면 murine 모델에서 가장 허 혈 성 절차는 45-60 분23.
정상적이 고 ischemically 손상 창 자에서 장 지하실의 성공적인 격리 문화에서 상피 복구의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 시스템에는 초점을 유일 하 게 혼자, 상피 하지 혈관 공급 또는 고려 하는 면역 세포 구성 요소를 연구 수 있습니다. 이 상피 세포 상호 작용 및 다른 성장 인자, 또는 문화 미디어를 보완 하 여 수술 또는 다음 암호 격리 하는 동안 관리 하는 치료에 반응 이외에 상해 다음 복구를 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 단계에서 가장 어려운 남아 있다, 심각 하 게 손상 된 루프에서 격리를 필요로 해 서 부드러운 진동 및 EDTA를 포함 하는 솔루션의 빠른 제거 경우에 납골당 될 중간 해리. 장의 이러한 루프는 철저 하 게 세척 되지, 하는 경우는 지하실 문화에 오염 될 가능성이 있다. 결과적으로, 항생제 antimycotic 솔루션 IESC 미디어 뿐만 아니라 두 박사 솔루션에 추가 되었습니다. 또 다른 토론 지점 일반 컨트롤로 수집 소장에 중점을 둡니다. 동물 수술 마 취 보조 국 소 빈 혈, 염증 성 중재자 순환의 가능성과 함께 조직의 조직 관류에 가능한 변경 된으로 "정상" 제어 조직 진정한 컨트롤을 대표 하지 않을 수 있습니다. 이 실험에서 제어 조직 조잡 한 및 조직학에 비해 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017) 다른 실험에서 허 혈을 받아야 하지 않은 동물에서 등장 하는 노트입니다.
요약 하자면, 돼지 장 허 혈, 그 밀접 하 게 인간의 허 혈 성 손상에서 발생 하는 어떤 모델의 재현 모델을이 방법에 설명 합니다. 또한, 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포의 고립은 설명,이 상피 수리 및 문화에서 치료에 대 한 가능한 응답을 공부 하는 역할.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, 및 부의 임상 과학 보급 자금에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
| Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
| Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
| Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
| Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
| Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
| Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
| LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
| SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
| 24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
| Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
| Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
| Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
| Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
| Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
| Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
| Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
| Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
| Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
| Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
| Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
| Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
| Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
| Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
| Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
| IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
| Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
| Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
| Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
| Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
| Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
| Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
| Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |
References
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