Licht-Blatt-Mikroskopie zur dreidimensionalen Visualisierung der menschlichen Immunzellen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um Immunzellen, eingebettet in eine dreidimensionale (3D) Kollagen-Matrix mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll arbeitet auch wie Zellwanderung in 3D zu verfolgen. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in der 3D Matrix eingesetzt werden.
Abstract
In Vivo, Aktivierung, Verbreitung und Funktion von Immunzellen, die alle auftreten in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung, z. B. in Lymphknoten oder Gewebe. Up to Date verlassen sich die meisten in-vitro- Systeme auf zweidimensionale (2D) Oberflächen, wie z. B. Zellkultur Platten oder Deckgläsern. Um optimal mimischen physiologischen Bedingungen in Vitroverwenden wir eine einfache 3D Kollagen-Matrix. Kollagen gehört zu den wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) und wurde häufig verwendet, um 3D Matrizen darstellen. Für 3D-Bildgebung, wird die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technik (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) mit hoher Geschwindigkeit, große Eindringtiefe, geringe Bleichen und Photozytotoxizität gekennzeichnet. Darüber hinaus ist Licht-Blatt Mikroskopie besonders vorteilhaft für Langzeitmessungen. Hier beschreiben wir einer optimierten Protokoll zum Einrichten und Verarbeiten von menschlichen Immunzellen, z.B. primären menschlichen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und natürlichen Killer (NK) Zellen in der 3D Kollagenmatrix für die Verwendung mit der Licht-Blatt-Mikroskopie für live Cell Imaging und feste Proben. Das Verfahren zur Bildaufnahme und Analyse der Zellwanderung werden vorgestellt. Ein besonderer Schwerpunkt ist gegeben, markieren Sie wichtige Schritte und Faktoren für die Probenvorbereitung und Analyse der Daten. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in einer 3D Kollagenmatrix eingesetzt werden und beschränkt sich nicht auf Immunzellen.
Introduction
Die meisten wissen über Migration Zellen stammt aus 2D Experimente1,2,3, die sind in der Regel in einem Glas oder Kunststoff-Oberfläche der Kultur/Bildgebung durchgeführt Gericht. Eine physiologische Szenario erfordert jedoch in den meisten Fällen eine 3D Mikroumgebung, in denen die extrazelluläre Matrix (ECM) eine entscheidende Rolle spielt. ECM bietet die 3D-Struktur ätherischen um richtige Zellmorphologie beizubehalten nicht nur, sondern bietet auch überleben Signale oder direktionale Hinweise für eine optimale Funktion von vielen Zellen4,5 . Daher muss eine 3D-Umgebung Zellfunktionen und Verhalten in einem Umfeld besser reflektieren die physiologischen Zusammenhang besser zu identifizieren.
Im menschlichen Körper üben die meisten Zellen vor allem Immunzellen, ihre Funktionen unter einem 3D Szenario. Zum Beispiel aktivierte T-Zellen patrouillieren Gewebe auf der Suche nach Zielzellen, naive T-Zellen durchwandern Lymphknoten auf der Suche nach ihrem cognate Antigen-präsentierenden Zellen während, die Migrationsmodus und Maschinen an die entsprechenden extrazelluläre angepasst sind Umwelt,3,6,7. Das 3D Kollagen-Gel wurde weithin als ein etabliertes und gut charakterisierten 3D Zelle Kultur System8,9,10eingesetzt worden. Unsere bisherige Arbeit zeigt, dass die primären menschliche Lymphozyten sind sehr mobil und mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von rund 4,8 µm/min in einem 0,25 % Kollagen-basierten Matrix11zu migrieren. Neuordnung des Zytoskeletts spielt eine Schlüsselrolle in der Zelle Migration12. Sammeln Beweise zeigt, dass Lymphozyten gelten nicht nur einen einzigen Modus der Migration noch können zwischen bestimmten Migrationsverhalten in Abhängigkeit von der Lage, Mikroumgebung, Zytokine, chemotaktische Gradienten und extrazelluläre welche Melodie Signale die Wanderungsverhalten in unterschiedlicher Weise 3.
Immunzellen Funktionen und Verhalten, z. B. Migration, Vorwölbung Bildung oder vesikulärer Transport zuverlässig zu analysieren ist es von großem Vorteil in der Lage sein, Bilder in relativ großen Mengen 3D in einer schnellen und zuverlässigen Art und Weise zu erwerben. Für 3D-Bildgebung bietet die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technologie (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) eine zufrieden stellende Lösung13,14. Während imaging Acquisition, wird eine statische Licht Dünnblech generiert, um die Probe beleuchten. Auf diese Weise auf die Fokusebene kann großflächig gleichzeitig beleuchtet werden, ohne die Zellen außerhalb der Ebene. Diese Funktion ermöglicht eine hohe Geschwindigkeit mit einem drastisch reduzierten Bleichen und Photozytotoxizität. In diesem Artikel beschreiben wir wie primäre menschliche Immunzellen mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren und analysieren Sie die Migration in einem Szenario mit 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die meisten in-vitro- Tests sind auf einer 2D Oberfläche, zum Beispiel in Petrischalen Zellkultur Platten oder auf Deckgläsern, durchgeführt, während in Vivo Zellen, vor allem Immunzellen, vor allem eine 3D Mikroumgebung erleben. Anzeichen dafür zeigt, dass Migrationsmuster von Immunzellen zwischen 2D und 3D Szenarien17unterscheiden. Die expressionsprofile von Tumorzellen unterscheiden sich darüber hinaus auch in 2D und 3D kultiviert Gewebe18,</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Institut für klinische Hemostaseology und Transfusionsmedizin für die Bereitstellung von Spenderblut; Carmen Hässig und Cora Hoxha für ausgezeichnete technische Hilfe. Wir danken Jens Rettig (Universität des Saarlandes) für den modifizierten pMAX-Vektor, Roland Wedlich-Söldner (Universität Münster) für das original LifeAct-Ruby-Konstrukt und Christian Junker (Universität des Saarlandes) zur Erzeugung der LifeAct-mEGFP-Konstrukt. Dieses Projekt wurde gefördert vom Sonderforschungsbereich 1027 (Projekt A2, B.Q.) und 894 (Projekt A1, m.h.). Das Licht-Blatt-Mikroskop wurde finanziert durch die DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
Riferimenti
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
