Mindre arbetstagare av ant arten Colobopsis explodens är dissekeras för att isolera vaxliknande innehållet lagras i deras hypertrophied mandibular körtel reservoarer för efterföljande lösningsmedel-extraktion och analys med gaskromatografi-masspektrometri. Anteckning och identifiering av flyktiga beståndsdelar med hjälp av öppen programvara MetaboliteDetector beskrivs också.
Syftet med detta manuskript är att presentera ett protokoll som beskriver metabolomiska analys av Bornean ‘exploderande myror’ som hör till gruppen Colobopsis Hypocysta (COCY). För detta ändamål är modell arten C. explodens begagnade. Myror som tillhör den mindre arbetare kasten äger distinkt hypertrophied mandibular körtlar (MGs). I territoriell strid använder de trögflytande innehållet i deras utvidgade mandibular körtel reservoarer (MGRs) för att döda rivaliserande leddjur i karakteristiska självmordsbenägen ‘explosioner’ av frivilliga bristning av den gastral integument (autothysis). Vi visar dissektion av arbetstagaren myror av denna art för isolering av gastral portion av vaxliknande MGR innehållet samt förteckning över de åtgärder som krävs för lösningsmedel-extraktion av de däri inneslutna flyktiga föreningarna med efterföljande gas kromatografi-masspektrometri (GC-MS) analys och förmodad identifiering av metaboliter som finns i extraktet. Förfarandet för dissektion utförs kylda villkor och utan användning av någon dissektion buffertlösning att minimera förändringar i den kemiska sammansättningen av MGR innehållet. Efter lösningsmedelsbaserade utvinning av flyktiga metaboliter som finns däri, presenteras nödvändiga åtgärder för att analysera proverna via vätska-injektion-GC-MS. Slutligen, databehandling och förmodad metabolit identifiering med användning av programvaran med öppen källkod, MetaboliteDetector visas. Med detta synsätt, profilering och identifiering av flyktiga metaboliter i MGRs av myror som hör till COCY gruppen via GC-MS och MetaboliteDetector programvaran blivit möjligt.
Det övergripande målet för det arbetsflöde som presenteras här är allmän utredning av kemiska sammansättningar i sekret av insekter. Detta görs med det primära syftet att belysa de ekologiska rollerna av secretionen som helhet eller av enstaka föreningar därav. Dessutom är vi intresserade av att undersöka de metaboliska vägarna bakom de föreningar som finns i respektive sekret. Särskilt körtel innehållet från myrorna (Hymenoptera, Formicidae) har fått stigande intresse under de senaste åren, eftersom de ger källor hittills outforskade potentiellt bioaktiva föreningar (lim, antimikrobiella medel, etc.)1, 2. mindre arbetstagaren myror av vissa arter som tillhör den COCY grupp3,4 föreskriva sådana föreningar som ingår i deras hypertrophied MGRs som sträcker sig från mouthparts att gaster5,6. När hotas av förmodad fiender, mindre arbetstagare av C. explodens7 och vissa relaterade arter kan göra användning av deras MGR innehåll på ett ovanligt sätt: de offra sig själva genom spricker deras gastral vägg för att mata ut klibbiga innehållet i den MGRs explosionsartat på motståndaren, dör varefter förmodade fienden är frihetsberövad och kan även5,6,8,9. Syftet med utvecklingen och användningen av de häri presenteras metoderna var för att förbättra förståelsen av den kemiska sammansättningen och arten av preliminärt toxiska beståndsdelar i denna ant sekretion.
Därför presenterar vi ett protokoll för dissektion av C. explodens arbetstagaren myror att erhålla gastral portion av deras vaxliknande MGR innehåll med efterföljande lösningsmedel-extraktion och analys med GC-MS.
GC-MS-analys är en av de väletablerade metoderna för profilering och identifiering av flyktiga metaboliter (volatilome) från insekter. Typiska analyter i myror inkluderar cuticular kolväten10, semiokemikalier11, och i allmänhet, föreningar med biologisk aktivitet12. Prover kan erhållas från hela djur eller kroppsdelar och kroppsvätskor isolerade via dissektion av insekt13,14. Provberedningstekniker inkluderar extraktion av däri inneslutna metaboliter med användning av lösningsmedel14 eller headspace-fast-fas-microextraction (HS-SPME)15.
För metabolomiska studier är det viktigt att proverna fryses snabbt direkt efter provtagningen, för att minimera förändringar i den kemiska sammansättningen och kvantiteten av föreningarna. Myrorna används för denna studie dödades av snabb nedfrysning på plats i en cool väska fyllda med djupfryst kallt förpackningar. Proverna förvarades sedan i frys-20 ° C med generator-driven elektricitet, innan de transporteras till laboratoriet på torris. Dissektion proceduren presenteras här erbjuder möjligheten att isolera MGR innehållet utan att analysera hela myran eller gaster som helhet, eftersom det har gjorts tidigare för olika COCY arter16,17,18. Dessutom möjliggör presenteras protokollet också direkt tillgång och analys av de omgivande körtlar och vävnader, som den venom körtel (VG)5,8, Dufours körtel (GD)8eller tarmarna i andra biologiska studier, eller Kontrollera om möjligt cross-föroreningar infördes under hantering eller dissektion av myrorna. För att minimera förändringarna i den kemiska sammansättningen av MGR innehållet under dissektion, antingen genom upptining prover eller genom att använda kemikalier, var dissektion processen optimerad för att utföras på en kall-packning (-20 ° C), utan användning av någon ytterligare buffertar, tvättmaskin lösningar eller lösningsmedel. De prover som erhållits via denna metod lämpar sig för kvalitativa och kvantitativa frågor.
Dataanalys i syfte att förmodad metabolit annotering och identifiering sker via programvaran öppen källkod MetaboliteDetector19, som utvecklades för automatisk analys av GC-MS-baserad metabolomik data. Den upptäcker enda ion toppar i kromatogram, utför en avfaltning steg och extraherar de deconvoluted masspektra av kemiska föreningar som ingår i de analyserade proverna. Förmodad identifiering av föreningar med MetaboliteDetector bygger på beslutsamma retention index (RI; Kovats RI kan beräknas automatiskt av programvaran) samt likheten mellan de deconvoluted masspektrum. RI och spektrala match faktor kan vara dubbelkontrolleras mot antingen befintlig referens bibliotek (som kan importeras, om de är i formatet gemensamma NIST), eller mot ett etablerat eget bibliotek. Detta är i enlighet med riktlinjerna för (förmodad) sammansatta identifiering föreslog, t.ex., av den kemiska analysen arbetar gruppen (CAWG) av metabolomik standarder initiativ (MSI), där minst två oberoende och ortogonala data i förhållande till en äkta förening (här retention tid (RT) /RI och masspektrum) analyseras identiska experimentella förhållanden föreslås som behövs för att bekräfta icke-romanen metabolit identifieringar20.
Komplett experimentet utförs på MGR innehållet av COCY modell arten C. explodens, men stegen dissektion kan också anpassas till isolera de andra körtlarna som finns i den ant gaster. Dessutom kan presenterar vi ett protokoll för den omfattande analysen av volatilome av MGR innehållet, de mer generella delarna av arbetsflödet som beskriver extraktion, GC-MS mätning och data utvärderingen också användas för analys och (förmodad) identifiering av flyktiga metaboliter i allmänhet.
Eftersom de experiment som beskrivs i detta manuskript utförs på insekter, krävs ingen etisk godkännande. Fältarbete, provtagning av myrorna, liksom deras användning för publicering är förenliga med de riktlinjer som reglerar detta projekt genom den Universiti Brunei Darussalam, Bruneis forskning och Innovation Centre och Bruneis skogsavdelningen, Brunei Darussalam.
I detta manuskript presenterar vi ett komplett protokoll för att analysera volatilome av innehållet i de hypertrophied MGRs av C. explodens mindre arbetstagaren myror. Eftersom myrorna används här kan ”explodera” och mata ut deras MGR innehåll okontrollerat vid beröring med pincett, är det rekommenderat att använda en ‘mjuka’ samling teknik som tillhandahålls av en insekt hygienfilter (figur 1). För vissa ant arter inklusive COCY myror, kan det vara nödvändigt att begränsa det maximala antalet myror till fem personer per 50 mL injektionsflaska, eftersom annars självförgiftning av myrorna (t.ex. genom ackumulering av myrsyra i headspace) kan förekomma. För frysning myrorna i fältet, får en cool väska fyllda med djupfryst kallt förpackningar användas. Proverna bör frusna snabbt och lagras kylda villkor (t.ex., -20 ° C, bästa vid-80 ° C), men det rekommenderas inte att döda och lagra myrorna i flytande kväve, eftersom ökad skada i deras körtlar har observerats med denna metod.
Metoden presenteras buffert – och lösningsmedelsfri dissektion är lämplig för att erhålla vaxliknande mandibular körtel reservoar innehållet samt andra körtlar närvarande i frysta arbetstagaren myror. För volatilome analys av MGR innehållet i C. explodensär viktiga aspekter beaktas under dissektion kontinuerlig kylning av myran (steg 2.1.4) och minimera cross-föroreningar av MG prov med andra körteln innehåll/vätskor i den ant gaster (steg 2.5, figur 4och figur 15). En betydande del av frysta myrorna skadas, antingen eftersom myrorna ‘exploderade’ under provtagning eller var transportskadad på torris från webbplatsen för provtagning till laboratoriet. Om regionen gaster är trasig, är dessa myror inte lämpliga för vidare analys (figur 2 c, D). Om bara antenner och ben saknas eller ã¤r brutna, kan dessa myror fortfarande användas för utvinning av MGR innehåll och ytterligare analys. Eftersom MGR innehåll kyls har C. explodens myror en vaxliknande konsistens är det enkelt att isolera dem med användning av dissektion nålar (steg 2.5, figur 3Eoch figur 14). Ytterligare försiktighet måste vidtas vid hantering av den klibbiga MGR innehåll. Det kan sticka till något komma i fysisk kontakt med det och också ofta följer dissektion tången, vilket ökar risken för förorening av andra prover. Det är nödvändigt att bara röra MGR innehållet med dissektion nålen och omedelbart överför det till i injektionsflaskor av glas som används för utvinning (steg 2.5 och 2.6). Dessutom rekommenderas att rengöra dissektion utrustningen med en MeOH/H2O blandning när du växlar mellan myror eller körtel-typer (steg 2,8).
Körtel innehållet i andra ant arter kan finnas i flytande form även under kyla med kallt förpackningar. I detta fall hela körteln inklusive membranet kan först isoleras och punkterade efteråt för att få innehållet. Flytande sekret kan också erhållas med hjälp av fina kapillär pipetter. Med en genomsnittlig kroppslängd på ca 4-5 mm (utan antenner) tillhör arbetare av C. explodens de mindre arterna i gruppen COCY. Deras ofta svullna gaster består av ca 2-2,5 mm i längd och 1-1,5 mm i bredd. Arbetstagare av så vitt största kända arter i gruppen COCY kan nå en storlek av ca 8 mm i kroppslängd med en gaster av ca 3 mm i längd och 2,5 mm i bredd. Eftersom protokollet är väl lämpad att dissekera och utreda enskilda myror och gasters av den storleken av olika COCY arter, här används dissektion instrument och mikroskopet kan behöva anpassas för att vara tillämplig för mindre myror eller mindre organ. Dessutom kanske antalet myror per analysprov ökas också.
Samtidigt dissekera myran för MGR innehållet, är det viktigt att inte skada någon andra körtlar eller tarmarna – vars innehåll kan cross-förorena provet (steg 2.5, figur 4 och figur 15). I optimala fall, hålls efter utvinning av MGR innehållet, generaldirektoratet, samt VG synbart intakt (figur 4). Föroreningar med innehållet GD, som ligger under MGRs, är svårt att helt undvika. Orsakerna till detta kan även partiell störningar körteln integritet under transport på torris från provtagning-webbplatsen till laboratoriet. Det är också möjligt att generaldirektorat som skadats under provtagning eller håller på att explodera, som vi har märkt för MGR i ett antal undersökta myror. Eftersom GD innehållet kan analyseras på samma sätt som MGR innehåll (avsnitten 3 och 4), kan resultaten jämföras med resulterande data efter analys av MGR innehåll proverna (avsnitt 6). När det gäller MGR innehåll extrakt erhållits från C. explodens myror, börja de föreningar som också ingår i GD eluera sent i kromatogrammet (figur 12). Att förhindra att ta miste på GD föreningar för MGR beståndsdelar, respektive metaboliterna kan undantas från ytterligare analys. Det är känt att generaldirektoraten kan också innehålla (mycket) volatila föreningar1,24, som vanligtvis eluera tidigt i GC-kromatogrammet från studier på andra ant arter.
I tidigare studier behandlar den kemiska sammansättningen av MGR innehållet i COCY myror, hela myror eller deras hela gasters var analyserat16,17,18,23, medan här i MGR innehållet själva erhölls via dissektion av myrorna.
Analysera dissekerade MGR innehållet tillåter utredarna att utföra en rad biokemiska studier, inklusive identifiering av metaboliter som finns däri. Eftersom den utförda studien här fokuserar på identifiering av flyktiga beståndsdelar som ingår i MGR av C. explodens, valdes GC-MS för sin analys (avsnitt 4). För detta, bör extrakten idealiskt mätas omedelbart efter beredning eller lagras vid-80 ° C fram till analys. Det bör noteras att (extended) lagring kan orsaka kemiska förändringar av extrakt (se anteckningar efter steg 3.3 och 4.2). Eftersom koncentrationen av MGR innehållet kan omfatta en rad flera storleksordningar, kan det vara nödvändigt att analysera MGR extrakt på olika GC split nyckeltal. Eftersom de två huvudsakliga föreningarna i MGR innehållet extrakt av myrorna tagit att exemplifiera det protokoll som orsakade kolumn överbelastning när split förhållandet 2:1 användes, analyserades detta prov en andra gång i högre split förhållandet 50: 1 (steg 4.3.1.2and figur 5). GC-MS parameterinställningarna presenteras i avsnitt 4 är lämpliga för data som genereras med GC-MS enheter anges i Tabell för material. Bredvid den RI calibrants (steg 4.1.1), bör ett lösningsmedel-tomt (steg 4.1.2) också analyseras för att identifiera icke-biologiska artefakter och föroreningar under efterföljande dataanalys. För metaboliten identifiering är det också viktigt att mäta autentiska standarder av kommenterad föreningar på samma villkor GC-MS som används för att analysera provextrakt (steg 5.4.7and efter). För att förbättra noggrannheten och tillförlitligheten hos de slutliga uppgifterna, rekommenderas det att analysera alla prov kategorier (vätska-blank RI calibrants, provextrakt och standarder) inom samma mätning sekvens. Dessutom bör de autentiska normerna analyseras vid en koncentration av jämförbara som observerats för provextrakt. Detta bidrar till att förbättra noggrannheten av RI värden och likheten mellan och massa standardspektrum, vilket slutligen leder till ökad och mer meningsfulla metabolit anteckning/identifiering. I detta syfte kan normerna upprepade gånger mätas med olika split faktorer.
För metaboliten identifiering, den sofistikerade programvaran, används MetaboliteDetector för spectra deconvolution och RI och spectra jämförelsen till ett genomfört NIST-bibliotek samt om en etablerad eget bibliotek (avsnitt 5). Det rekommenderas att köra MetaboliteDetector på en 64-bitars LINUX-baserat operativsystem (t.ex. KUBUNTU) och kopiera den genererade *. CDF datafiler (steg 4,4) från den Bärbar datalagring på den lokala hårddisken. MetaboliteDetector kan importera GC-MS rådata i centroiden eller profil netCDF-format. Programvara för de flesta GC-MS instrument bör kunna konvertera inspelade rådata till detta format19. Innan du börjar i analys av data, rekommenderas det starkt att läsa litteraturen som finns för tidigare MetaboliteDetector programvaruversioner att bli bekant med funktionerna och grafiska gränssnitt19,25, 26.
För RI kalibrering och efterföljande beräkning av RI-värde av de sammansatta topparna som är närvarande i provextrakt används ett bibliotek som innehåller RIs och spektra av RI calibrants (här, n-alkaner). Sådana ett bibliotek kan antingen vara egenföretagare etablerat, eller en redan existerande (‘CalibrationLibrary_Alkanes’) kan vara hämtade27. Medföljande standard standardbiblioteket innehåller RIs och spectra för n-alkaner alltifrån C09 till C39 som har analyserats enligt beskrivningen i avsnitt 4. Det medföljande biblioteket gör det möjligt för användare som arbetar med metabolit detektor att direkt börja med kalibreringen av deras uppgifter. Om det behövs, kan detta bibliotek också utökas med ytterligare poster för ytterligare alkanes. Baserat på likheten mellan referens och experimentellt härledda RIs och masspektrum (se steg 5.3 och delsteg, figur 7, figur 8, bild 9), anteckning eller identifiering av föreningar kan vara utfört (steg 5,4 och delsteg, (Se figur 11). Det är också viktigt att efter automatisk databehandling med MetaboliteDetector, användaren kommer att manuellt kontrollera för rätt peak plockning och spektrum deconvolution genom att inspektera masspektra underliggande ‘triangeln’ för varje förmodad förening av intresse. Dessutom beroende på GC-MS instrumenteringen och parameterinställningarna används för data generation, kan anpassningar av de presenterade MetaboliteDetector inställningarna behövas. Programvaran MetaboliteDetector är kapabla att utföra många fler användbara operationer än förklarade i detta manuskript, t.ex. visning av extraherade ion nuvarande (EIC) kromatogram, export av kromatogram som .csv, automatisk batch-kvantifiering av föreningar och många fler.
Det protokoll som presenteras i detta manuskript kan fungera som förslag på experiment som utförs av andra forskare med fokus på isolering av körtlar eller körtel innehållet från insekter, volatilome analys, samt metabolit identifiering.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering för denna studie erhölls genom Wien Science och Technology Fund (WWTF) LS13-048 till ISD. Speciellt tack till Diane W. Davidson (University of Utah, nu pensionerad) för att dela sin kunskap om Bornean COCY myrorna med oss. Vi uppskattar administrationerna av Kuala Belalong fältet studier Center (KBFSC) och Universiti Brunei Darussalam (UBD) för projektgodkännande samt Bruneis skogsavdelningen och Bruneis forskning och Innovation Centre för behörighet att samla in myror och godkännande och utfärdandet av exporttillstånd. Speciellt tack till UBD och KBFSC personal, särskilt Muhammad Salleh bin Abdullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei och Kushan Tennakoon för att underlätta vår forskning.
Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
Bucket with crushed ice | |||
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
Distilled water | |||
Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
Helium (5.0 – F50) | Messer | 102532501 | |
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |