Karakterisering van aquatische Biofilms met stroom Cytometry
Summary
Stroom cytometry in combinatie met visuele clustering biedt een easy-to-use en snelle methode voor het bestuderen van aquatische biofilms. Het kan worden gebruikt voor de karakterisering van de biofilm, de detectie van veranderingen in de structuur van de Gemeenschap van de biofilm, en detectie van abiotische deeltjes ingebed in de biofilm.
Abstract
Biofilms zijn dynamische consortia van micro-organismen die een belangrijke rol in zoetwater ecosystemen spelen. Door het veranderen van de structuur van hun gemeenschap, biofilms snel inspelen op de veranderingen in het milieu en kan dus worden gebruikt als indicatoren van de kwaliteit van het water. Op dit moment is biofilm beoordeling grotendeels gebaseerd op integratieve en functionele eindpunten, zoals fotosynthetische of luchtwegen activiteit, die geen informatie over de structuur van de biofilm-Gemeenschap geven. Stroom cytometry en computationele visualization bieden een alternatieve, gevoelig en eenvoudig-en-klare methode voor de beoordeling van de samenstelling van de Gemeenschap, met name van het photoautotrophic deel van zoetwater biofilms. Het vereist alleen eenvoudige bereiding van de monsters, waarna de gehele steekproef wordt uitgevoerd door de cytometer van de stroom. De eencellige optische en fluorescerende informatie wordt gebruikt voor computationele visualisatie en biologische interpretatie. De belangrijkste voordelen ten opzichte van andere methoden zijn de snelheid van de analyse en de aard van de hoge-informatie-inhoud. Stroom cytometry biedt informatie over verschillende cellulaire en biofilm eigenschappen in een enkele meting: deeltjesgrootte, dichtheid, pigment content, abiotische inhoud in de biofilm, en grof taxonomische informatie. Echter, biedt geen informatie over biofilm samenstelling op het niveau van de soorten. We zien hoog potentieel in het gebruik van de methode voor de milieumonitoring van aquatische ecosystemen en als een evaluatie van de eerste biofilm stap die stroomafwaarts informeert gedetailleerde onderzoeken door aanvullende en meer gedetailleerde methoden.
Introduction
Biofilms zijn dynamische consortia van micro-organismen die een sleutelrol in zoetwater ecosystemen spelen, variërend van primaire productie, nutriënten fietsen en waterzuivering tot het beïnvloeden van de distributie van micro-organismen en hun biodiversiteit in het ecosysteem 1. Wanneer biofilms worden blootgesteld aan het veranderlijke omgevingsomstandigheden of stressoren, zoals chemische stoffen, de structuur van hun gemeenschap snel verschuift richting meer tolerante soorten2,3. Hun hoge gevoeligheid verandert biofilms in aantrekkelijke modelsystemen voor milieu bewaking4, maar geen van de huidige methoden perfect afgestemd is op de dynamiek van een biofilm Gemeenschap daadwerkelijk te traceren in een snelle en gemakkelijke manier.
De gebruikte set van methoden voor het karakteriseren van biofilms bestaat uit de meting van de functionele en structurele eindpunten. Op het niveau van de gehele Gemeenschap bevat fotosynthetische en respiratoire activiteit alsook de activiteit van extracellulaire enzymen informatie over de functionele toestand van de biofilm5,6,7,8 ,9. De toename van de biomassa wordt gebruikt als een indicator voor de totale groei van de biofilm. Structurele veranderingen zijn momenteel gemeten met behulp van traditionele soorten identificatie met de lichte microscopie van of nucleotide gebaseerde technieken (bijvoorbeeldkleurovergang gelelektroforese (DGGE), geautomatiseerde ribosomal intergenic spacer denaturering analyse (ARISA), metagenomics)10,11,12. Deze methoden informatie verstrekken maar zijn tijdrovend worden uitgevoerd of wordt vereist specifieke kennis, of zijn nog in ontwikkeling. Tot slot, nieuwe methoden voor de evaluatie van de extracellulaire polymere stoffen (EPS)13,14 en de biofilm het platform1, terwijl gevoelig, zijn laag-doorvoer en hebben nog geen ontwikkeld naar redenen van toezicht afgeeft.
Het is duidelijk dat voor een volledige karakterisering van zoetwater biofilms, het noodzakelijk is om het combineren van verschillende methoden, die inzicht geven in de biofilm functie, de samenstelling en de architectuur. Voor milieubewaking, aan de andere kant, is een snelle en gevoelige methode welk vermag opsporing van wijzigingen in de biofilm en inschakelen van elementaire biologische interpretatie van de verschuivingen op de functionele en structurele niveau vereist.
We hebben een nieuwe methode voor de karakterisering van de microbiële Gemeenschap van de fototrofe component van stream biofilms (periphyton), die is snel genoeg voor controledoeleinden, en tegelijkertijd voldoende informatie verstrekt over de biofilm Gemeenschap ontwikkeld structuur om biologische interpretatie15. Het is gebaseerd op eencellige stroom cytometry (FC) van biofilm monsters en computationele visualisatie wordt gekoppeld en geeft informatie over optische en fluorescerende eigenschappen van de biofilm op het niveau van één cel.
De werkstroom na de biofilm bemonstering bestaat voor de bereiding van de monsters in de vorm van ultrasoonapparaat en fixatie van de monsters, gevolgd door de beoordeling van het monster door de stroom cytometry grootte-gebaseerd filteren. De opgehaalde gegevens bevatten informatie over de verschillende cellulaire eigenschappen in een enkele meting: deeltjesgrootte, dichtheid, pigment content, abiotische inhoud (bijvoorbeeld microplastics) in de biofilm. Deze set van gegevens is dan geanalyseerd via computationele visualisatie met behulp van visuele stochastische buurman insluiten (viSNE)16, waarmee snel en gemakkelijk interpretatie van de gegevens. Hoewel een paar weken moeten instellen en optimaliseren van de methode, eenmaal ingesteld, duurt het slechts een paar uur van het verzamelen van de biofilm monsters voor de interpretatie van de resultaten.
De belangrijkste voordelen van de onderhavige methode over anderen zijn de snelheid van analyse en hoge-informatie-inhoud. Bovendien kunnen de monsters voor enkele weken na het verzamelen zonder verlies van hun optische en fluorescentie-eigenschappen worden opgeslagen. Dit kan zeer nuttig zijn wanneer de karakterisering van een groot aantal monsters is vereist, zoals grote bemonstering studies of biomonitoring programma’s, maar kan ook voorzien in een aanzienlijke hoeveelheid informatie in kleinere verkennende studies.
De gepresenteerde protocol is gebaseerd op analyse van de stroom-cytometrische van fototrofe biofilms (periphyton) verzameld vanaf verschillende locaties van een stream. Vele stappen van het protocol, bijvoorbeeld de selectie van de programmagebieden geschikt voor controledoeleinden, afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek en daarom niet kunnen worden voorgeschreven. Anderen toestaan minder vrijheid en vereisen dat het protocol is gevolgd, dit wordt duidelijk gemaakt in het hieronder gedetailleerd protocol.
Het protocol begint met de selectie van de programmagebieden voor milieubewaking biofilm gebaseerde. De volgende stap is aan opstelling de stroom-cytometer (FC), zodat de afmetingen inschakelen discriminatie tussen verschillende fototrofe organismen leven in biofilms in de gecontroleerde omgeving. Dit wordt uitgevoerd door het verzamelen van monsters van de biofilm van de sites, identificeren de fluorescerende eigenschappen van verschillende soorten waarvan de aanwezigheid in de biofilm en het opzetten van de stroom-cytometer met lasers en filters waarmee de meting bij de passende optische golflengten. Zodra de FC is set-up, biofilms kunnen worden verzameld van de sites van tijd tot tijd de optische en fluorescerende eigenschappen van de afzonderlijke deeltjes aanwezig zijn in de biofilm gemeten door stroom cytometry en de gegevens geanalyseerd door visuele clustering. Voor betere interpretatie van de resultaten is het mogelijk om te bouwen van een referentiedatabank FC lokale biofilm-levende soorten en hun fenotypes en gebruiken van de database om te identificeren van verschillende taxonomieën in de FC-gegevens. Validatie is het mogelijk door middel van fluorescentie gebaseerde sortering van de geïdentificeerde clusters van afzonderlijke cellen met behulp van FACS en microscopie gebaseerde taxonomische identificatie van de aanwezige soort. Een schematische voorstelling van het protocol wordt gegeven in Figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat hierboven beschreven is relatief eenvoudig te implementeren. Terwijl de gepresenteerde standaardinstellingen zijn geschikt voor alle fototrofe biofilm getest tot nu toe getoond, is optimalisatie (zoals beschreven in het protocol) echter noodzakelijk om te maximaliseren van de informatie verkregen uit de methode. Inderdaad, de optische en fluorescerende eigenschappen van biofilms kunnen variëren, afhankelijk van de omgevingsomstandigheden (seizoen, temperatuur, chemische samenstelling van het water)<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het gepresenteerde werk werd gesteund door een SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) en een onderzoeksbeurs van Velux (Amplebig). We zouden graag bedanken Bettina Wagner voor hulp bij het experimentele werk.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
Riferimenti
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton – comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. . Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry – Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
