Caractérisation des Biofilms aquatiques avec écoulement Cytometry
Summary
Cytométrie en combinaison avec les clusters visual vous propose une méthode rapide et facile à utiliser pour l’étude des biofilms aquatiques. Il peut être utilisé pour la caractérisation de biofilm, détection des changements dans la structure des communautés biofilm et détection des particules abiotiques incorporé dans le biofilm.
Abstract
Les biofilms sont des consortiums dynamiques des micro-organismes qui jouent un rôle clé dans les écosystèmes d’eau douce. En modifiant leur structure de la Communauté, les biofilms réagir rapidement aux changements environnementaux et peut être ainsi utilisés comme indicateurs de la qualité de l’eau. Actuellement, biofilm évaluation repose principalement sur des extrémités intégratives et fonctionnelles, telle que l’activité photosynthétique ou respiratoire, qui ne fournissent pas d’informations sur la structure communautaire de biofilm. Cytométrie en flux et visualisation informatique offrent une méthode alternative, sensible et facile à utiliser pour l’évaluation de la composition de la Communauté, en particulier de la partie photoautotrophes des biofilms d’eau douce. Il faut seulement préparation des échantillons de base, après quoi la totalité de l’échantillon est géré par le cytomètre en flux. L’information optique et à fluorescence de cellule unique est utilisée pour le calcul visualisation et interprétation biologique. Ses principaux avantages par rapport aux autres méthodes sont la vitesse d’analyse et de la nature de la haute teneur en information. Cytométrie en flux fournit des informations sur plusieurs caractéristiques cellulaires et biofilm dans une mesure unique : granulométrie, densité, teneur en pigments, abiotique contenu dans le biofilm et des informations taxonomiques grossiers. Toutefois, il ne fournit pas d’informations sur la composition de biofilm sur le niveau de l’espèce. Nous voyons un potentiel élevé dans l’utilisation de la méthode pour la surveillance environnementale des écosystèmes aquatiques et une évaluation initiale de biofilm, étape qui informe en aval détaillée enquêtes par des méthodes complémentaires et plus détaillées.
Introduction
Les biofilms sont des consortiums dynamiques des micro-organismes qui jouent un rôle clé dans les écosystèmes d’eau douce, allant de la production primaire, cycle des éléments nutritifs et de la purification de l’eau à influencer la distribution des micro-organismes et de leur biodiversité dans l’écosystème 1. lorsque les biofilms sont exposés aux conditions environnementales changeantes ou aux facteurs de stress, tels que les produits chimiques, leur structure de la communauté se déplace rapidement vers plus tolérants à l’espèce2,3. Leur haute sensibilité transforme biofilms en systèmes modèles attrayants pour surveillance environnementale4, toutefois, aucune des méthodes actuelles est parfaitement adapté pour réellement tracer la dynamique d’une communauté de biofilm de manière rapide et facile.
L’ensemble couramment utilisé des méthodes pour caractériser les biofilms consiste à mesurer les paramètres fonctionnels et structurels. Au niveau de l’ensemble de la Communauté, l’activité photosynthétique et respiratoire ainsi que l’activité des enzymes extracellulaires fournit des informations sur l’état fonctionnel du biofilm5,6,7,8 ,,9. Accumulation de biomasse est utilisée comme un indicateur de la croissance globale de biofilm. Des changements structurels sont actuellement mesurés soit en procédant à l’identification d’espèces traditionnelles avec la microscopie photonique ou axée sur les nucléotides techniques (p. ex., électrophorèse en gel en gradient (DGGE), automatisé ribosomique espaceur intergénique en présence analyse (ARISA), métagénomique)10,11,12. Ces méthodes fournissent des informations mais prennent du temps pour effectuer ou exiger de connaissances spécifiques ou sont encore en cours d’élaboration. Enfin, les nouvelles méthodes d’évaluation des substances polymériques extracellulaires (EPS)13,14 et le biofilm architecture1, tandis que sensible, sont de faible débit et n’ont pas encore été mis au point vers des fins de contrôle.
Il est évident que pour une caractérisation complète des biofilms d’eau douce, il est nécessaire de combiner plusieurs méthodes différentes, qui donnent un aperçu de la fonction de biofilm, la composition et l’architecture. Pour la surveillance de l’environnement, d’autre part, une méthode rapide et sensible qui est capable de détecter des changements dans le biofilm et de permettre une interprétation biologique fondamentale des déplacements au niveau fonctionnel et structurels est nécessaire.
Nous avons développé une nouvelle méthode pour la caractérisation de la communauté microbienne de la composante phototrophe de stream biofilms (périphyton), qui est assez rapide pour des fins de contrôle et en même temps fournit suffisamment d’informations sur la communauté de biofilm structure pour permettre une interprétation biologique15. Il est basé sur la cytométrie unicellulaires (FC) des échantillons de biofilm et couplé avec visualisation informatique et fournit des informations sur les propriétés optiques et fluorescentes du biofilm au niveau de la cellule unique.
Le flux de travail après l’échantillonnage de biofilm se compose de préparation de l’échantillon sous la forme de la sonication, de fixation et de filtrage par taille des échantillons suivis d’évaluation de l’échantillon par cytométrie en flux. Les données acquises renseignent sur plusieurs traits cellulaires dans une mesure unique : granulométrie, densité, pigment contenu, contenu abiotique (p. ex. microplastiques) dans le biofilm. Cet ensemble de données est qu’analysé via computational visualisation à l’aide de visual voisin stochastique embedding (viSNE)16, qui permet une interprétation rapide et facile des données. Bien que quelques semaines sont nécessaires pour configurer et optimiser la méthode, une fois mis en place, cela prend seulement quelques heures de collecte des échantillons de biofilm d’interprétation des résultats.
Les principaux avantages de la méthode présentée sur les autres sont la vitesse d’analyse et de la haute teneur en information. En outre, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs semaines après le prélèvement sans perte de leur optique et propriétés de fluorescence. Cela peut être très utile lorsque la caractérisation d’un grand nombre d’échantillons est nécessaire, comme grand échantillonnages ou programmes de biosurveillance, mais peut aussi fournir une quantité importante d’informations dans les plus petites études exploratoires.
Le protocole présenté repose sur l’analyse de la cytométriques des phototrophes biofilms (périphyton) recueillie à différents sites d’un flux. Beaucoup d’étapes du protocole, par exemple la sélection des sites appropriés pour la pré-écoute, dépendre des objectifs de la recherche et par conséquent ne peut être prescrit. D’autres permettent moins de liberté et nécessitent que le protocole est suivi de près, ceci est rendu clair dans le protocole détaillé ci-dessous.
Le protocole commence par la sélection des sites pour la surveillance environnementale axée sur le biofilm. L’étape suivante consiste à installer le cytomètre en flux (FC) ainsi que ses dimensions permettent la discrimination entre les différents organismes phototrophes vivant dans les biofilms en milieu contrôlé. Cela est effectué par prélèvement d’échantillons de biofilm sur les sites, en identifiant les propriétés fluorescentes de différentes espèces présentes dans le biofilm et de mettre en place le cytomètre de flux avec des lasers et des filtres qui permettent de mesurer à l’optique longueurs d’onde. Une fois que le FC a été mise en place, les biofilms peuvent être recueillies sur les sites périodiquement, les propriétés optiques et fluorescentes des particules présentes dans le biofilm mesurée par cytométrie en flux-et les données analysées par regroupement visuel unique. Pour mieux interpréter les résultats, il est possible de construire une base de données de référence FC d’espèces locales de biofilm-vie et leurs phénotypes et la base de données permet d’identifier les différentes classifications dans les données FC. La validation est possible par le biais de tri basés sur la fluorescence des clusters identifiés des cellules simples utilisant des FACS et axée sur la microscopie des identification taxonomique des espèces présentes. Une représentation schématique du protocole est donnée à la Figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus est relativement simple à implémenter. Toutefois, les paramètres par défaut présentés ont été montré pour convenir à tous les phototrophe biofilm testé jusqu’à présent, optimisation (comme décrit dans le protocole) est nécessaire pour maximiser les informations obtenues par la méthode. En effet, les propriétés optiques et fluorescentes de biofilms peuvent varier, selon les conditions environnementales (saison, température, composition chimique de l’eau)<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail présenté a été soutenu par un SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) et une subvention de recherche de Velux (Amplebig). Nous tenons à remercier Bettina Wagner de l’aide avec le travail expérimental.
Materials
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
Riferimenti
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