Cytometry와 수생 Biofilms의 특성

Summary

시각적 클러스터링 함께에서 cytometry 수생 biofilms 공부는 쉬운–사용 하 고 빠른 방법을 제공 합니다. 그것은 biofilm 특성, biofilm 커뮤니티 구조에 변화의 탐지 및는 biofilm에 포함 하는 비 생물 적인 입자의 탐지에 사용할 수 있습니다.

Abstract

Biofilms는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄. 그들의 사회 구조를 바꾸어 서, biofilms 환경 변화에 신속 하 게 대응 하 고 따라서 수 질의 지표로 사용할 수 있습니다. 현재, biofilm 평가 주로 기반으로 통합 및 기능 끝점, 광합성 이나 호흡 활동, biofilm 커뮤니티 구조에 정보를 제공 하지 않습니다를 합니다. Cytometry 및 전산 시각화 커뮤니티 구성, 특히 민물 biofilms의 photoautotrophic 부분에 대 한 평가 대 한 대안, 민감한, 그리고 사용 하기 쉬운 메서드를 제공합니다. 전체 샘플 교류 cytometer 통해 실행 후 기본 샘플 준비를 필요 합니다. 단일 셀 광과 형광 정보 전산 시각화 및 생물 학적 해석에 사용 됩니다. 다른 방법에 비해 주요 장점을 분석 하 고이 정보 콘텐츠 자연의 속도. Cytometry 단일 측정에 여러 휴대 및 biofilm 특성에 정보를 제공 합니다: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠, biofilm, 및 거친 분류학 정보 abiotic 콘텐츠. 그러나, 그것은 종 수준에 biofilm 구성에 정보를 제공 하지 않습니다. 우리 수생 생태계의 환경 모니터링을 위한 방법의 사용에서 높은 잠재력을 하류 알리는 단계 초기 biofilm 평가로 보완 하 고 더 상세한 방법으로 조사를 상세한.

Introduction

Biofilms는 미생물 및 생태계의 생물 다양성의 분포에 영향을 미치는 주요 생산, 영양소 사이클링, 및 물 정화에서 이르는 민물 생태계에서 중요 한 역할을 하는 미생물의 동적 컨소시엄 ¹. biofilms는 변화 하는 환경 조건 또는 화학 물질, 같은 스트레스에 노출 되 면 그들의 지역 사회 구조 신속 하 게 더 관대 종^2,3쪽으로 이동. 그러나 그들의 높은 감도 현재 방법의 아무도 완벽 하 게 실제로 biofilm 커뮤니티의 동적을 추적 하는 빠르고 쉬운 방법에 적합 한 biofilms 환경 모니터링⁴, 매력적인 모델 시스템으로 변합니다.

기능과 구조 끝점의 측정 biofilms 하 방법의 일반적으로 사용 되 세트에 의하여 이루어져 있다. 전체 사회의 수준에서 광합성 및 호흡 활동 뿐만 아니라 세포 외 효소의 활동 정보를 제공 합니다 biofilm^{5,6,7,8의 기능 상태에 ,9}. 바이오 매스 계산 전체 biofilm 성장 표시기로 사용 됩니다. 구조적인 변화는 현재 가벼운 현미경 검사 법 또는 뉴클레오티드 기반 기술 (예를 들어, 그라데이션 젤 전기 이동 법 (DGGE), 자동화 된 ribosomal intergenic 스페이서를 변성 시키기 전통적인 종 식별을 사용 하 여 측정 분석 (아리사) metagenomics)^10,,1112. 이러한 방법 정보를 제공 하지만 수행, 또는 특정 지식이 필요로 수 있습니다 또는 아직 개발 중인. 마지막으로, 세포 외 고분자 물질 (EPS)^13,14 와 biofilm 건축¹을 민감한, 동안 평가 대 한 새로운 방법을 낮은 처리량 고 쪽으로 아직 개발 하지 않은 목적을 모니터링합니다.

민물 biofilms의 완전 한 특성, 그것은 biofilm 기능, 구성 및 아키텍처에 대 한 통찰력을 제공 하는 여러 가지 다른 방법을 결합 하는 데 필요한 것이 분명 하다. 환경 모니터링, 다른 한편으로는 biofilm에서 변화를 감지 하 여 설정 기능 및 구조적 수준에서 교대의 기본적인 생물 학적 해석 수 있는 신속 하 고 중요 한 방법이 필요 합니다.

우리 스트림 biofilms (periphyton), 목적, 모니터링을 위한 충분히 빠른 이며 동시에 biofilm 커뮤니티에 충분 한 정보를 제공 한다 광합성의 미생물 지역 사회 특성에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다. 생물 학적 해석¹⁵수 있도록 구조입니다. 그것은 단일 셀 cytometry (FC) biofilm 샘플에 기반 하 고 전산 시각화 함께 단일 셀 수준에 biofilm의 광과 형광 속성에 정보를 제공 합니다.

Biofilm 샘플링 후 워크플로 샘플 준비 쥡니다, 고정, cytometry에 의해 샘플을 평가 하 여 다음 샘플의 크기 기반 필터링의 형태로 이루어져 있다. 단일 측정에 여러 세포 특성에 정보를 제공 하는 인수 데이터: 입자 크기, 밀도, 안료 콘텐츠는 biofilm에서 비 생물 적인 콘텐츠 (예: microplastics). 데이터의이 세트는 보다 시각적 확률적 이웃 (viSNE)¹⁶, 데이터의 신속 하 고 쉽게 해석 가능 하 게 포함을 사용 하 여 계산 시각화를 통해 분석. 몇 주를 설정 하 고 메서드를 최적화 하는 데 필요한 있지만 한번 설정 하 고, 결과 해석 하는 biofilm 샘플 수집에서 단 몇 시간 걸리는.

다른 사람 제시 방법의 주요 장점은 속도 분석 및이 정보 콘텐츠는. 또한, 샘플의 그들의 광 손실 및 형광 속성 없이 컬렉션 후 몇 주 동안 저장할 수 있습니다. 샘플의 많은 수의 큰 샘플링 연구 등 biomonitoring 프로그램 필요 하지만 상당한 양의 작은 예비 연구에 정보를 제공할 수 있습니다 때이 매우 유용할 수 있습니다.

제시 프로토콜 스트림의 다른 위치에서 수집 된 광합성 biofilms (periphyton)의 흐름-cytometric 분석을 기반으로 합니다. 프로토콜, 예를 들면 목적, 모니터링에 대 한 적절 한 사이트의 선택의 많은 단계 연구의 목표에 따라 달라 집니다 그리고 그러므로 처방 될 수 없습니다. 다른 더 적은 자유를 허용 하 고 필요한 프로토콜은 밀접 하 게 뒤에, 상세한 프로토콜 아래에서 분명히 만든.

프로토콜은 biofilm 기반 환경 모니터링에 대 한 사이트의 선택과 시작합니다. 다음 단계는 set-up 교류 cytometer (FC)의 측정 사용 모니터링된 환경에서 biofilms에 살고 다른 광합성 유기 체 사이 차별. 이 사이트를 식별 하는 다른 종에 존재 하는 biofilm 고 교류 cytometer 레이저와 광학에 적절 한 측정을 사용할 수 있는 필터 설정의 형광 속성에서 biofilm 샘플을 수집 하 여 수행 됩니다. 파장입니다. Biofilms 수 FC 설정 후 사이트에서 주기적으로, cytometry에 의해 측정 하는 biofilm 및 시각적 클러스터링 분석 데이터에 단일 입자의 광학 및 형광 재산 수집. 결과의 더 나은 해석에 대 한 로컬 biofilm 살아있는 종의 FC 참조 데이터베이스 및 그들의 고기를 빌드하고 FC 데이터에서 다른 분류를 식별 하는 데이터베이스를 사용 가능 하다. 유효성 검사 FACS 및 현재 종의 분류학 식별 현미경-기반을 사용 하 여 단일 셀의 확인 된 클러스터의 정렬 형광 기반을 통해 가능 하다. 프로토콜의 회로도 그림 1에서 주어진 다.

Protocol

1. 생태계 선택 및 Biofilm 샘플링 관심의 수생 생태계를 선택 하 고 샘플링 사이트 biofilms 성장. 얕은 부분으로 스트림의 중간 물 흐름을 느리게 그리고 돌 streambed biofilm 첨부 파일에 대 한 적절 한17,18. 옵션: 없으면 사이트 충분 한 표면에 biofilm 첨부 파일에 대 한 또는 사이트 내에서 biofilms 가변성을 감소, biofilm 첨부 파일 (예: 유리 ?…

Representative Results

(그림 1)을 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 스위스에서 로컬 스트림의 여러 사이트에서 샘플 분석 했다. 각 사이트에서 3 개의 비슷한 크기의 돌 (10-12 cm) 찍은, 그리고 biofilms 돌 닦 했다. 샘플 다음 sonicated, 고정, 필터링 되었고 나중 cytometry에 의해 분석. 교류 cytometer와 사용 하는 참조 데이터베이스의 설치 이전 종이15에 설명 된 ?…

Discussion

위에서 설명한 프로토콜은 구현 하려면 상대적으로 간단 합니다. 그러나, 표시 기본 설정을 모든 광합성 biofilm 지금까지 테스트에 적합 하도록 표시 되었습니다, 하는 동안 최적화 (프로토콜에서 설명) 하는 대로 방법에서 얻은 정보를 최대화 하기 위해 필요 하다. 실제로, biofilms의 광과 형광 속성 환경 조건 (계절, 온도, 물의 화학 성분)¹에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서,이 가…

Materials

Multimeter	WTW	MultiLine 3620 IDS	For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner	VWR International	97043-986	Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios	Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Plate reader	Tecan	Infinite M200	used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter	Beckman Coulter	MoFlo Astrios	Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 135	Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab	MathWorks	R2013a	software for numerical computing
CYT	Dana Pe'er Lab	Version 1.1	free interactive visualization tool for analysis of cytometry data