En effektiv prøve forberedelse metode til at øge kulhydrat Ion signaler i Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation massespektrometri
Summary
En protokol for at øge kulhydrat ion signaler i MALDI massespektrometri af reformen krystallinske strukturer under prøven forberedelse processer godtgøres.
Abstract
Forberedelse af prøver er en kritisk proces i massespektrometri (MS) analyse af kulhydrater. Selvom matrix assisted laser desorption/Ionisation (MALDI) MS er den foretrukne i kulhydrat analyse metode, dårlig ion signal og data reproducerbarhed af kulhydrat prøver fortsat at være alvorlige problemer. Til kvantitativ analyse af kulhydrater er en effektiv analytiske protokol giver overlegen datakvalitet nødvendige. Denne video viser prøve forberedelse protokoller for at forbedre signal intensitet og minimere data ændring af kulhydrater i MALDI-MS. Efter tørring og krystallisering af prøven dråber reformeret krystal morfologi af methanol før massespektrometrisk analyse. Ekstraudstyr i kulhydrat signal er undersøgt med MALDI imaging massespektrometri (IMS). Eksperimentelle resultater viser, at crystal reformationen justerer krystallinske strukturer og omfordeler kulhydrat analysander. I forhold til metoden tørrede droplet forberedelse i konventionelle MALDI-MS, reformere kulhydrat krystal morfologier med methanol viser betydeligt bedre signal intensitet, ion image distribution og data stabilitet. Da protokollerne vist heri ikke indebærer ændringer i prøven sammensætning, er de generelt gælder for forskellige kulhydrater og matrixer.
Introduction
Kulhydrat analyse er et vigtigt og udfordrende emne. Kulhydrater og deres derivater spiller vigtige roller i levende organismer1,2,3. Disse molekyler har komplicerede strukturer og er tilbøjelige til at nedbryde. Mange af dem kan ikke tydeligt kendetegnet på grund af vanskeligheder med separation og afsløring. Selv om matrix assisted laser desorption/Ionisation (MALDI) massespektrometri (MS) er blevet anvendt til analyse af en bred vifte af biomolekyler, på grund af dens følsomhed og forståelige resultater4, fortsætter analysere kulhydrater bruger MALDI-MS at være en stor udfordring på grund af lav ionisering effektiviteten af sådanne molekyler5. Kemiske forædling er en almindelig måde at effektivisere ionisering af kulhydrater6,7, men sådanne procedurer er tid og prøve forbrugende. Desuden er ionisering effektiviteten af derivatized kulhydrater stadig lavere end for proteiner. Således er er udviklingen af metoder til at forbedre kulhydrat signal i MALDI-MS uden komplicerede procedurer nødvendige.
Anvendelsen af MALDI-MS til kvantitativ analyse er en anden udfordrende emne. Et stort problem for MALDI-MS er, at dens følsomhed og data reproducerbarhed er kritisk afhængig prøve forberedelse protokoller og eksperimenterende parametre. I mange tilfælde er kvantitativ analyse af MALDI-MS upålidelige som følge af heterogene prøve morfologier og analysanden distribution. Et velkendt eksempel er prøver forberedt med en 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) MALDI matrix. Når DHB er udkrystalliseret langsomt under omgivende miljø, er omfanget af analysand iblanding i matrix krystaller uforudsigelige, fordi deraf følgende prøver viser uregelmæssige morfologier. Sådanne prøver består normalt af store kanyle-formet og fine krystaller. Når DHB er udarbejdet ved hjælp af et flygtigt opløsningsmiddel og/eller en opvarmet prøve plade, resulterer en hurtig tørringsproces i mere homogene fine krystaller og bedre kvantitative resultater8,9,10. Denne teknik er kendt som “omkrystallisering” MALDI prøver. Forbedring tilskrives bedre inkorporering af analysander i fine matrix krystaller under hurtig krystallisering processen. Vi har også vist, at justere sample forberedelse miljø reduceret heterogenitet af kulhydrat signal og forbedret kvantitative resultater11,12. Resultaterne i disse værker foreslår at prøve morfologi er en kritisk faktor for kulhydrat signalkvalitet. For at udvikle en generel strategi for daglige analyse, er en effektiv prøve reformationen metode giver forbedret kulhydrat følsomhed påkrævet.
Vi har systematisk undersøgt sammenhængen mellem prøve morfologi og kulhydrat følsomhed i MALDI-MS i en nylig rapport13. Resultater opnået ved hjælp af flere vigtige kulhydrater og matrixer show, det bedste signal ekstraudstyr er opfyldt af recrystallizing tørret MALDI prøver. Morfologi af prøver udarbejdet ved hjælp af metoden konventionelle tørrede slipværktøj (DD) er reformeret ved hurtig omkrystallisering med methanol (MeOH). Detaljerede prøve forberedelse protokoller er vist her. Protokollen består af tre hovedtrin, herunder prøve plade forkonditionering, prøve deposition og omkrystallisering og massespektrometri analyse. De udnyttede kulhydrater omfatter sialyl-lewis et (SLeA) og maltoheptaose (MH). DHB er brugt som en model matrix. Resultaterne viser, at kulhydrat signal intensitet og rumlige fordeling forbedret markant efter omkrystallisering. Sådan en metode kan anvendes til prøver med andre populære matrixer, herunder 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) og α– cyano-4-hydroxycinnamic syre. Denne metode fungerer som en generel tilgang, der nemt kan integreres i rutinen laboratorium for kulhydrat analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prøven heterogenitet er et afgørende problem i MALDI-MS. DD er mest almindeligt anvendte prøve forberedelse metode, men de resulterende krystaller er meget heterogen. Sådanne prøver viser dårlig skud til skud og prøve til prøve signal reproducerbarhed. Derfor er søger efter “sweet spots” i stikprøven områder under dataopsamling en fælles procedure i MALDI eksperimenter. Prøverne heterogene er uegnet til kvantificering i rutineanalysemetodens.
I den aktuelle undersøgelse, er MALDI…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
Riferimenti
- Holme, D. J., Peck, H. . Analytical Biochemistry. , (1998).
- Costello, C. E. Time, life … and mass spectrometry – New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
- Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
- Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
- Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
- Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
- Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
- Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
- Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
- Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
- Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
- Ou, Y. -. M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409 (2016).
- Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
- Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of ‘near’ homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
- Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).
