En effektiv prov förberedelse metod att förbättra kolhydrat Ion signaler i Matrix-assisted Laser Desorption/jonisering masspektrometri
Summary
Ett protokoll för att förbättra kolhydrat ion signaler i MALDI masspektrometri av reformera kristallina strukturer under provet bearbetningsprocesser demonstreras.
Abstract
Provberedning är en kritisk process i masspektrometri (MS) analys av kolhydrater. Även om matrix-assisted laser desorption/jonisering (MALDI) MS är metoden för val i kolhydrat analys, dålig ion signal och data reproducerbarhet av kolhydrat prover fortfarande allvarliga problem. För kvantitativ analys av kolhydrater krävs en effektiv analytiska protokoll som ger överlägsen datakvalitet. Denna video visar prov förberedelse protokoll för att förbättra signalintensitet och minimera data variant av kolhydrater i MALDI-MS. Efter torkning och kristallisering av provet droppar reformeras crystal morfologi av metanol före massa spektrometriska analys. Förbättringen i kolhydrat signal undersöks med MALDI imaging masspektrometri (IMS). Experimentella resultat visar att crystal reformationen justerar kristallina strukturer och omfördelar kolhydrat analyter. I jämförelse med den torkade droplet förberedelse metoden i konventionella MALDI-MS, reformera kolhydrat crystal morfologier med metanol visar betydligt bättre signalintensitet, ion bild distribution och data stabilitet. Eftersom protokollen visade häri inte innebär förändringar av provets sammansättning, är de allmänt tillämpliga på olika kolhydrater och matriser.
Introduction
Kolhydrat analys är ett viktigt och utmanande ämne. Kolhydrater och deras derivat spelar viktiga roller i levande organismer1,2,3. Dessa molekyler har komplicerade strukturer och är benägna att bryta ner. Många av dem kan inte tydligt karakteriseras på grund av svårigheter i separation och detektion. Även om matrix-assisted laser desorption/jonisering (MALDI) masspektrometri (MS) har tillämpats på analys av ett brett utbud av biomolekyler, på grund av dess känslighet och begripliga resultat4, fortsätter analysera kolhydrater med VITEK-MS att vara en stor utmaning på grund av låg jonisering effektiviteten av sådana molekyler5. Kemiska derivatisering är ett vanligt sätt att effektivisera jonisering av kolhydrater6,7, men sådana förfaranden är tid och provet tidskrävande. Förutom, jonisering effektiviteten av derivatized kolhydrater är fortfarande lägre än för proteiner. Således är det nödvändigt att utveckla metoder att förbättra kolhydrat signal i MALDI-MS utan komplicerade procedurer.
Tillämpningen av MALDI-MS på kvantitativ analys är en annan utmanande ämne. Ett stort problem för MALDI-MS är att dess känslighet och data reproducerbarhet bygger kritiskt på prov förberedelse protokoll och experimentella parametrar. I många fall är kvantitativ analys av MALDI-MS otillförlitliga på grund av heterogena prov morfologier och analyt distribution. Ett välkänt exempel är prover beredd med en 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) MALDI matris. När DHB är kristalliserade långsamt under omgivande miljö, är omfattningen av analyten införlivande i matrix kristaller oförutsägbara, eftersom resulterande prover visar oregelbundna morfologier. Sådana prover består normalt av stor nål-formade och fina kristaller. När DHB bereds med flyktiga lösningsmedel och/eller en uppvärmd prov tallrik, resulterar en snabb torkningsprocess i mer homogena fina kristaller och bättre kvantitativa resultat8,9,10. Denna teknik är känd som ”omkristallisering” av MALDI prover. Förbättringen kan tillskrivas bättre införlivande av analyter fina matrix kristaller under snabb kristallisation. Vi har också visat att justera prov förberedelse miljön minskas heterogenitet kolhydrat signal och förbättrad kvantitativa resultat11,12. Resultaten i dessa verk tyder på att provet morfologi är en avgörande faktor vid fastställandet av kolhydrat signalkvalitet. För att utveckla en allmän strategi för daglig analys, krävs en effektiv prov reformationen metod som ger förbättrad kolhydrat känslighet.
Vi har systematiskt undersökt sambandet mellan prov morfologi och kolhydrat känslighet i MALDI-MS i en senaste rapport13. Resultat som uppnåtts med hjälp av flera viktiga kolhydrater och matriser Visa att de bästa signal förbättring är uppfyllt av recrystallizing torkade MALDI prover. Morfologi av prover beredd med metoden konventionella torkade droplet (DD) reformeras genom snabb omkristallisering med metanol (MeOH). De detaljerade prov förberedelse protokoll demonstreras här. Protokollet består av tre huvudsteg, inklusive prov plattan prekonditionering, prov nedfall och omkristallisering och masspektrometri analys. De utnyttja kolhydraterna inkluderar sialyl-lewis en (SLeA) och maltoheptaose (MH). DHB används som en modell matris. Resultaten visar att kolhydrater signalintensitet och rumsliga fördelning förbättrats markant efter omkristallisering. En sådan metod kan tillämpas för prover med andra populära matriser, inklusive 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) och α– cyano-4-hydroxycinnamic acid. Denna metod fungerar som en allmän riktlinje som enkelt kan integreras i rutinen laboratorium för kolhydrat analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prov heterogenitet är ett avgörande problem i MALDI-MS. DD är de vanligaste prov förberedelse metod, men de resulterande kristallerna är mycket heterogena. Dessa prover visar dålig skott-till-skott och prov till prov signal reproducerbarhet. Därför är söker efter ”sweet spots” i provet områden under datainsamling ett vanligt förfarande i MALDI experiment. Dessa heterogena prover är olämpliga för kvantifiering i rutinanalyser.
I den aktuella studien, är MALDI prov morfologi …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
Riferimenti
- Holme, D. J., Peck, H. . Analytical Biochemistry. , (1998).
- Costello, C. E. Time, life … and mass spectrometry – New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
- Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
- Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
- Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
- Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
- Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
- Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
- Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
- Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
- Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
- Ou, Y. -. M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409 (2016).
- Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
- Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of ‘near’ homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
- Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).
