मुद्रित Glycan सरणी: छोटे जानवरों में विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी परिचालित की प्रदर्शनों की एक साथ की गई है के विश्लेषण के लिए एक संवेदनशील तकनीक
Summary
यह काम छोटे जानवरों में एंटी-कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी प्रसारित करने के विश्लेषण के लिए छपी glycan सरणी (पीजीए) तकनीक की क्षमता को दर्शाता है ।
Abstract
एक दिए गए व्यक्ति के विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी परिसंचारी की प्रदर्शनियां अक्सर अपनी प्रतिरक्षा स्थिति के साथ जुड़ा हुआ है । न केवल व्यक्तिगत प्रतिरक्षा हालत आंतरिक और बाहरी संभावित खतरे संकेतों का मुकाबला करने में सफलता निर्धारित करता है, लेकिन यह भी विरोधी glycan एंटीबॉडी प्रसारित की एक विशेष पैटर्न के अस्तित्व (और उनके सीरम वैज्ञानिक स्तर भिन्नता) एक हो सकता है कुछ रोग की स्थिति की शुरुआत और प्रगति के महत्वपूर्ण मार्कर । यहां, हम एक मुद्रित Glycan सरणी (पीजीए) का वर्णन आधारित पद्धति है कि बहुत उच्च संवेदनशीलता के साथ Glycan लक्ष्यों के सैकड़ों उपाय करने का अवसर प्रदान करता है; नमूना है, जो एक आम मौजूद प्रतिबंध जब छोटे जानवरों (चूहों, चूहों, हंसटर, आदि) के लिए मानव रोगों के पहलुओं को संबोधित मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है की एक ंयूनतम राशि का उपयोग करना । इस दृष्टिकोण के एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हम बालब/सी चूहों में प्राकृतिक विरोधी glycan एंटीबॉडी की प्रदर्शनों की पड़ताल से प्राप्त परिणामों को दिखाते हैं । हम यह प्रदर्शित करते है कि प्रत्येक बालब/सी माउस के अध्ययन में शामिल है, आनुवंशिक रूप से समान होने के बावजूद और एक ही स्थिति के तहत बनाए रखा, प्राकृतिक विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी के एक विशेष स्वरूप विकसित करता है । इस काम के लिए पीजीए प्रौद्योगिकी के उपयोग का विस्तार करने के लिए प्रदर्शनों (विशिष्टताओं) और विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी, दोनों स्वास्थ्य में और किसी भी रोग हालत के दौरान परिचालित के स्तर की जांच का दावा है ।
Introduction
एंटीबॉडी सीधे वायरस1,2 और बैक्टीरिया2,3, के पूरक प्रणाली4,5 सक्रिय करके रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ हमारे बचाव में एक केंद्रीय भूमिका निभा और phagocytosis की बढोतरी6. इसके अतिरिक्त, वे कैंसर लक्ष्यीकरण और घातक कोशिकाओं7के उंमूलन में आवश्यक तत्व हैं, और homeostasis रखरखाव8,9।
प्रतिरक्षा प्रणाली के विकारों10 और कैंसर11-स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ रोगों में परिणाम कर सकते हैं । इन सभी रोग स्थितियों आदर्श एक कुशल उपचार के लिए एक त्वरित निदान की मांग । स्व-प्रतिरक्षित विकारों के मामले में, एंटीबॉडी के अधिकांश मामलों में सीरम वैज्ञानिक की उपस्थिति10,12प्रतिरक्षण के निदान के लिए एक कारक है । ये एंटीबॉडी कोशिका की सतह और extracellular के साथ प्रतिक्रिया एंटीजन और, वे अक्सर कई वर्षों के लिए स्व-प्रतिरक्षित रोग की प्रस्तुति से पहले मौजूद हैं10,12. प्रतिरक्षा की कमी और कैंसर भी रक्त परीक्षण है कि या तो एंटीबॉडी, या उनके कार्यात्मक गतिविधि11के रूप में प्रतिरक्षा तत्वों के स्तर को मापने के साथ का निदान कर रहे हैं ।
परिसंचारी एंटीबॉडी और उनके सीरम वैज्ञानिक स्तर के प्रदर्शन की प्रक्रिया की पहचान के लिए एक पूर्वानुमान स्थापित और उल्लेख किया रोग की स्थिति के सभी की प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए सर्वोपरि हैं । हम पहले विभिन्न पशु प्रजातियों में घूम एंटीबॉडी के विश्लेषण के लिए पीजीए तकनीक की क्षमता का प्रदर्शन किया है13–16, सीरम वैज्ञानिक नमूनों की बड़ी मात्रा के उपयोग को कम करने, समस्या से बचने एंटीबॉडी के पार से जुड़े-जेट17 और उच्च-15एंटीबॉडी के एक व्यापक प्रदर्शनों की रूपरेखा के प्रवाह की अनुमति ।
Glycan आधारित immunoassays मुख्य रूप से वातानुकूलित हैं, अंय कारकों के अलावा, मूल और कार्बोहाइड्रेट के उत्पादन, जो लाइगैंडों15,18,19,20 के संबध और बाध्यकारी निर्धारित द्वारा ,21. Glycan आधारित immunoassays निलंबन (microspheres) में विकसित किया जा सकता है15,21,22 या फ्लैट में सक्रिय सतहों15,21,22, २३,२४. पिछले शामिल एलिसा (इन तरीकों के सबसे पारंपरिक) और पीजीए । एक ही प्रयोगात्मक सेटिंग15,25,26,27में इन तरीकों की तुलना में ज्यादा डेटा नहीं है । हमने पहले इन immunoassays की प्रभावकारिता और selectivity की तुलना प्रोफ़ाइल एंटी-glycan एंटीबॉडी में व्यक्तिगत मानव प्लाज्मा के नमूनों से की है15. ऐसे विरोधी लक्ष्यीकरण के रूप में कुछ एंटीबॉडी के लिए एक/बी रक्त समूह, सभी immunoassays उंहें सांख्यिकीय महत्व के साथ पता लगाने सकता है और वे सकारात्मक एक दूसरे के साथ संबंधित15,18,21। इस बीच, विरोधी P1 एंटीबॉडी मुख्य रूप से पीजीए द्वारा सबसे अधिक भेदभाव की शक्ति के साथ पता चला रहे थे, और विभिंन glycan द्वारा किए गए संकल्पों में कोई संबंध नहीं था आधारित15immunoassays,18, 21. तरीकों के बीच ये अंतर मुख्य रूप से एंटीबॉडी/प्रतिजन अनुपात और glycan उंमुखीकरण15से संबंधित थे । एलिसा और निलंबन arrays और अधिक पीजीए से अधिक विशिष्ट बाध्यकारी के लिए अतिसंवेदनशील होते है क्योंकि इन15तरीकों में एंटीबॉडी पर प्रतिजन के एक अतिरिक्त है । इसके अतिरिक्त, पीजीए में glycans के उंमुखीकरण और एलिसा और निलंबन15arrays में से अधिक प्रतिबंधित है । एलिसा सुविधाजनक है जब अध्ययन glycans के एक सीमित पैनल भी शामिल है । निलंबन arrays के साथ साथ, एलिसा व्यापक परख विंयास के बारे में लचीलापन प्रदान करता है । पीजीए खोज दृष्टिकोण15,18,21,28के लिए असाधारण सुविधाजनक है । इन स्पष्ट फायदे और नुकसान के बावजूद, तीन उल्लेख immunoassays glycan के विभिंन पहलुओं-एंटीबॉडी बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है । अध्ययन के अंतिम लक्ष्य है एक और अधिक उपयुक्त पद्धति के चयन का मार्गदर्शन करेंगे ।
वर्तमान कार्य का उद्देश्य छोटे जानवरों में एंटी-glycan एंटीबॉडी को प्रसारित करने की प्रदर्शनियों के लिए पीजीए टेक्नोलॉजी का उपयोग करना है । एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, हम यहां मौजूद एक विस्तृत प्रोटोकॉल पीजीए द्वारा वयस्क बालब/सी चूहों में प्राकृतिक विरोधी कार्बोहाइड्रेट एंटीबॉडी की प्रदर्शनों की तरह का आकलन करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycan microarrays प्रोटीन-Glycan इंटरैक्शन४०का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य उपकरण बन गए हैं. वर्तमान काम पीजीए प्रौद्योगिकी पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए बालब/सी चूहों में विरोधी कार्बोहाइड?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम “Fondo डी Investigaciones Sanitarias” (वित्तीय संस्थाओं) द्वारा कार्लोस III स्वास्थ्य संस्थान, स्पेनी स्वास्थ्य मंत्रालय से अनुदान PI13/01098 द्वारा समर्थित किया गया था । डीबी-जी को अनुदान समझौता ६०३०४९ (ò) के तहत यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) द्वारा वित्तपोषित एक पद डॉक्टरेट अनुसंधान स्थिति से लाभान्वित किया गया । NK, एनएस, और एनबी का काम अनुदान #14 द्वारा समर्थित किया गया था-रूसी विज्ञान फाउंडेशन के 50-00131 । DB-जी को उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मार्ता Broto, जे पाब्लो साल्वाडोर और एना Sanchis के लिए उनके आभार व्यक्त करना चाहता है, और अलेक्जेंडर Rakitko सांख्यिकीय विश्लेषण में सहायता के लिए । “पीएलए डे Doctorats उद्योगपति de la Secretaria d’Universitats मैं Recerca डेल Departament d’Empresa मैं Coneixement de la Generalitat de Catalunya (अनुदान संख्या २०१८ DI 021) के समर्थन के साथ । हम संस्थागत सहायता के लिए CERCA कार्यक्रम/Generalitat de Catalunya का धन्यवाद करते हैं ।
Materials
| Antibodies | |||
| biotinylated goat anti-human Igs | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Ref. #: 31782 | |
| biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: 31807 | |
| Equipment | |||
| Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5 | Scienion AG, Berlin, Germany | http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/ | |
| Stain Tray (slide incubation chamber) | Simport, Beloeil, QC, Canada | Ref. #: M920-2 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | Ref. #: 5810 R | |
| Pipettes | Gilson, Middleton, WI, USA | http://www.gilson.com/en/Pipette/ | |
| Slide Scanner | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | ScanArray GX Plus | |
| Shaking incubator | Cole-Parmer, Staffordshire, UK | Ref. #: SI50 | |
| Biological samples | |||
| BALB/c mice sera | This paper | N/ A | |
| Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) | Immuno-Gem, Moscow, Russia | http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531 | |
| Chemicals, Reagents and Glycans | |||
| Glycan library | Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia | N/ A | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, | Ref. #: A9418 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | Ref. #: 411000 | |
| Tween-20 | Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain | Ref. #: 655204 | |
| Phospahte buffered saline (PBS) | VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain | Ref. #: E404 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Ref. #: S2002 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate | Thermo Fisher Scientific | Ref. #: S21381 | |
| Streptavidin Cy5 conjugate | GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK | Ref. #: PA45001 | |
| Materials | |||
| N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H | Schott-Nexterion, Jena, Germany | Ref. #: 1070936 | |
| Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | Ref. #: WHA10347509 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Ref. #: 0030120086 | |
| Software and algorithms | |||
| ScanArray Express Microarray Analysis System | PerkinElmer | http://www.per | |
| kinelmer.com/microarray | |||
| Hierarchical Clustering Explorer application | University of Maryland, MD, USA | http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/ | |
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