Etikett-fri neutrofila berikning från patientderiverade luftvägarna sekretion använder slutna tröghetsbaserad mikrofluidik
Summary
I denna forskning visar vi en etikett-fri neutrofila separationsmetod från kliniska luftvägarna sekret med slutna drift av spiral tröghetsbaserad mikrofluidik. Den föreslagna metoden skulle expandera de kliniska in vitro- analyserna för olika sjukdomar i andningsorganen.
Abstract
Luftvägarna sekret innehåller ett stort antal immunrelaterade celler, t.ex., neutrofiler, makrofager och lymfocyter, som kan användas som en viktig resurs för att utvärdera en mängd olika lungsjukdomar, både för forskning och kliniska ändamål. Dock på grund av heterogena och trögflytande hur patientens slem finns det för närvarande ingen tillförlitlig dissociation-metod som inte skadar värd immuncellerna i patientens luftvägar utsöndringen. I denna forskning introducerar vi ett prov förberedelse metod som använder tröghetsbaserad mikrofluidik patientens immunförsvar bedömning. Oavsett de heterogena fluidic egenskaperna hos de kliniska proverna, den föreslagna metoden återvinner mer än 95% av neutrofiler från luftvägarna sekretion prover som är utspädda 1.000-faldig med milliliter ren koksaltlösning. Som recirkulerande koncentrerad utdataström till reservoaren utfallsprov, tillhandahålls en hög koncentration, återhämtning och renhet av immuncellerna; återcirkulation är ansedd en kompromiss till singel-kör spruta-baserade operation tröghetsbaserad mikrofluidik. Slutna driften av spiral mikrofluidik ger leukocyter utan fysiska eller kemiska störningar, vilket framgår av den phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA)-inducerad elastase release av sorterade neutrofiler.
Introduction
Eftersom celler är inkapslade i en stor mängd slem i luftvägarna sekret, har funktionell bedömning av leukocyter genom in vitro- test hindrats. Ditiotreitol (DTT) är den vanligaste lyseringsbuffert att dissociera och homogenisera sputum för Cytologisk analys och identifiering av medlare samtidigt som den ger acceptabel lönsamhet för isolerade celler1,2. Dock kan DTT störa yta-bundna antigener av luftvägarna neutrofiler, vilket resulterar i störningar av neutrofil funktion såsom elastase och myeloperoxidas (MPO) release2,3. Få studier av människans luftvägar neutrofil funktion har därför utförts med perifert blod neutrofiler, som inte kan avslöja de fysiologiska egenskaperna av pulmonell4. Under tiden gjort tröghetsbaserad mikrofluidik framsteg isolera cellerna från olika patient biomatrices5,6. Jämvikten mellan tröghetsbaserad hiss styrkor och Dean drar justerar partikel/cellen beroende på deras storlek, vilket gör att etiketten-fri partikel separation7. Vår grupp tidigare infört en prov förberedelse metod för cirkulerande tumör celler8,9, patogener i blod8, celler från en suspension kultur10,11, 12, och polymorfonukleära leukocyter (PMNs) från blodet13,14.
Här introducerar vi ett protokoll för att förbereda immunceller från patientens luftvägar sekret med slutna tröghetsbaserad mikrofluidik för en nedströms i vitro assay, såsom neutrofila elastase (NE) analysen. Denna metod ger både hög koncentration och återhämtning, särskilt när det finns en betydande överlappning i lateral riktning av cell/partikel som den cellen/partikel-of-intressen är att tas bort, vilket är vanligt förekommande i kliniska prover. Genom recirkulerande inre väggen (IW)-fokuserade stora partiklar eller celler tillbaka till ingående prov röret, partikel eller cell-av-intressera koncentrat i ursprungliga behållaren, medan bakgrunden vätskor med små mucin aggregat passera genom avfall reservoaren. Trots de heterogena fluidic egenskaperna hos kliniska prover, den föreslagna metoden återställer konsekvent över 95% av neutrofiler från luftvägarna sekretion prover som är utspädda 1.000-faldig med en ren saltlösning (~ 1 mL). Däremot presenterar metoden lysis ett brett utbud av PMNs återvinningsprocent beroende på provet skick. Föreslagna protokollet fångar leukocyter i ett etikett-fri sätt med inga fysiska eller kemiska störningar, vilket ger möjlighet att skörda känsliga celler från kliniskt utmanande biometri med minimalt invasiva ingrepp.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tröghetsbaserad mikrofluidik lokalisera partikel och celler vid en viss lateral position i en mikro-kanal baserat på deras storlek5,18,19,20. På grund av den kombinerade effekten av dekanus dra kraft och den tröga lyftkraft i böjda microchannel, stora partiklar eller neutrofiler (> 10 µm) är belägna inne i kanalen och små partiklar, slem aggregat och skräp mindre än 6 µm är place…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH/NIAID (R21AI119042) samt NIH U24 prov Sparing assay program (U24-AI118656).
Materials
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
Riferimenti
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
