Summary
ここでは、提案する植物病原菌と植物病原性をテストするためのプロトコルいもち病。このレポートは菌分離株の pathotype の大規模スクリーニングに貢献し、分子育種中植物の耐性メカニズムを理解するための優れた出発点として役立ちます。
Abstract
植物病原性菌による潜在的な脅威から身を守るための強力なシステムを所有しています。農学上重要な植物は、ただし、このような病原体と戦う対策の現状はあまりにも保守的な証明している、したがって、十分に効果的なと潜在的環境は危険が伴います。したがって、それは非常に制御する病害抵抗性遺伝資源の識別、分離抵抗性遺伝子の解析と分子育種を通じて自然を支援する宿主抵抗性要因を識別するために必要です抵抗力がある品種。この点で、繁殖植物抵抗性遺伝子を開発し正確・迅速かつ大規模な接種方法を確立する必要があります。米は、真菌病原体イネいもち病菌原因重症症状を爆破し、損失をもたらします。最近では、イネいもち病菌は、植物病原菌の相互作用のメカニズムを研究するためのモデル生物として浮上しています。したがって、私たちはイネいもち病菌の特定は、植物病原性試験法の開発を報告します。このメソッドは、胞子懸濁液を噴霧接種法と負傷接種キューブ菌糸または胞子懸濁液の液滴の両方を提供します。戸建イネ葉の負傷の接種法の重要なステップは、ホスト貫入抵抗による任意の干渉を回避する植物の葉で傷をすることです。このプロトコルがスプレー/負傷したイネいもち病菌菌株の生じの迅速、正確、かつ大規模なスクリーニングに貢献します。これは統合し、体系的な植物感染症法は植物病理学の問題の広い視野を得るための優れた出発点となります。
Introduction
イネいもち病菌によるイネいもち病は、水稲品種世界中1,2のための最も深刻な病気のひとつです。イネいもち病菌感染宿主植物プロセス分生胞子生産と付着、分生胞子の発芽および付着器形成、形成穿と感染菌糸の分化は、病気を広める3。 これらすべての段階が多く他植物病原糸状菌、一般的で、確かに、任意の 1 つのステージの封鎖ホスト植物の感染が防止します。経済的重要性、遺伝的少ないのためイネいもち病菌は、植物病原菌の相互作用1,4のメカニズムを研究するためのモデル生物として浮上しています。したがって、スクリーニングとデザイン小説候補遺伝子の同定と真菌病原性の分子機構の解明を助けるこれら発達段階のイネいもち病菌の分子基盤を勉強殺菌剤5。
イネいもち病菌感染に関する最近の報告は前侵入の段階、特に、制御、付着器形成、浸透ペグ、伝染の成長3,の分子機構に焦点を当てています。6。 したがって、イネいもち病菌感染をテストする詳細なプロトコルを開発するが不可欠です。本明細書で詳細な胞子懸濁液とイネいもち病菌菌糸のプラグに傷接種スプレーを介した感染アッセイを利用して感染テスト方法を提案する.本報告では、プロトコルは、噴霧のため制御する溶液の調製と植物イネいもち病菌の菌糸のプラグを介した接種菌株のうち、文化に焦点を当てください。詳細は以下で、メソッドの全体のワークフローを示した概略図でこれらの手順を説明し、典型的な病変は、それぞれ図 1 2に示すように。
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Protocol
1 イネいもち病菌の分生胞子懸濁液の噴霧接種法
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M.griseaの真菌培養
- 菌のオートミール トマト寒天 (OTA) 培養液を準備します。
- オートミールの 30-50 グラムの重量を量る 800 mL の蒸留水または脱イオンされた水 (ddH2O) にこれを追加し、電気ポットで 30 分間混合物を沸騰させます。
- ガーゼの部分をビーカーにゆでオートミール ジュースをフィルターします。
- 150 mL トマト ジュースと寒天 20 g をビーカーに濾液に追加し、追加 ddH2O 1,000 mL。
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実験材料の準備
- イネ (イネ) 品種 Lijiangxintuan heigu (LTH) ddH2O 3 d 約 50 種を浸すまたはオオムギの約 50 種を浸す (オオムギcv 黄金の約束) ddH2O 約 1 d のために。
- 湿ったガーゼで米や麦の種子をラップし、28 ° C で 10 cm × 10 cm の直径の約 30 ペトリ皿で湿潤ろ紙上発芽イネ種子の発芽時間は約 2-3 d、オオムギ種子の発芽時間は約 2 d。温室内の相対湿度は約 70% です。
- オートクレーブ potting 土と水遣りを使用して鍋で米や麦の苗を植えるし、バーミキュ ライトの層でそれらをカバーします。
- 1 約 25 ° C でキャビネットの適切な温室の成長の植物を置く 〜 2 週間。
- (各サークルには 8 cm 径はず) 無菌手術ハサミで円のフィルター紙の 3 層をカットし、100 mm 滅菌プラスチック プレートの上に配置。
- ろ紙を浸して皿ごとに ddH2O を追加します。
- フィルター ペーパーは完全に濡れていることを確認が、余分な水を追加しません。
- 真空ポンプの過剰な水を削除します。
- 米/麦の穂をサポートする培養皿に場所 2 滅菌つまようじ葉;スペース、つまようじ 2 ~ 3 cm。
- 稲の葉に種子を播種後 2 週間を収集したり種子を播種後 7 d の大麦の葉を取る。
- 米/麦の 4-6 葉苗を使用して、上から 〜 5 cm で茎の下の部分をカットし、葉を収集します。
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噴霧接種プロトコル
- ~ 4 d のためのサーモスタットのインキュベーター (25 ° C) で太田プレートに真菌のひずみを文化します。
- DdH20.5 - 5 mL ピペット各 4 日古いプレートを使用して O 〜 2 mL を加えます。
- 接種ループ菌糸破片にイネいもち病菌の野生型株と変異株の菌糸体を擦る。
- 菌糸体の破片を集めるし、新しい太田プレートに転送。菌糸破片やクリーン ベンチのブロードライを取る。
- 24-48 h の泊 (10 h) の日 (14 h) および 23 ° C の 25 ° C で温室の分生子の成長に必要な湿度を確保するためのガーゼの 3 層プレートをカバーします。
- それぞれの皿に ddH2O 2 mL を追加し、レンズ ペーパーの 2 層を介して濾過に続いて滅菌綿棒で胞子を優しくこすり。培地の表面に傷を付けないように注意します。
- 100-1,000 μ L ピペットで新しい 50 mL のチューブに分生胞子懸濁液を転送します。
- 25 ° C で 5,000 × g の最低 5 分間遠心
- 上澄みを除去し、0.025% (v/v) トゥイーン 20 ソリューションの mL あたり 2 × 104分生胞子を与えるにペレットを再懸濁します。トゥイーン 20 ソリューションは通常、約 10-20 mL です。
- ハンドヘルド スプレーに胞子懸濁液を注ぐ。
- 7 日古い大麦幼植物の葉約 10 mL の 2 週齢イネやオオムギの葉の上に胞子懸濁液を卵巣摘出し、25 ° c ~ 24 h. スプレーの暗く、湿気の多い部屋で 0.025% (v/v) トゥイーン 20 ソリューション コントロール植物を孵化させなさい。
- 12 時間日長の 25 ° C で蛍光灯の下の別の湿ったチャンバーに葉を転送します。
- 接種後 5 d で病気の症状を記録します。~ 6 cm の長さの罹病イネ/麦ブレードを調べます。評価基準は、国際稲研究所 (IRRI) のいもち病抵抗性のスコアリング システムによると。いもち病抵抗性のスコアリング システムの詳細は、表 1のとおりです。
- 写真の菌の感染を評価する葉。感染は、3.6 cm2あたりの病変の数によって評価されました。
2. 接種菌糸体キューブまたはイネいもち病菌の分生胞子懸濁液液滴が負傷しました。
- 3 戸建米/麦の葉の主な静脈の 2 ~ 3 cm 長い傷をこすり解剖針を使用して、葉を透過しないように注意してください。
- つまようじにスクレイプの葉を置いて、0.02% (v/v) 液滴の層を形成する葉のトゥイーン 20 ソリューションをスプレーします。
- 太田プレートから各イネいもち病菌菌株 (野生型、変異体、補体のひずみ、またはその他の試験菌) の 0.5 × 0.5 cm 菌糸プラグをカットします。
- 菌糸のプラグを入れてや負傷者に胞子懸濁液の 25 μ L 滴葉および 25 ° c 3-8 d のため湿気の多い室内で葉を孵化させなさい。
- 5-7 d 後接種で病変を調べます。調査方法は、噴霧接種法のためだったと同じです (1.3.13 の手順を参照してください)。
- ~ 6 cm の長さの罹病イネ/麦ブレードを調べるし、菌の感染を評価するそれらを撮影します。感染は、3.6 cm2あたりの病変の数によって評価されました。
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Representative Results
技術全体のワークフローは、図 1に示すです。14 日齢の影響を受けやすいイネ幼植物の植物感染アッセイを行った (イネcv CO 39) 7 日齢の影響を受けやすいオオムギ葉または (H. オカダンゴムシcv 黄金の約束)7,8,9。イネ葉の感染症のためにテストするため Com1 削除変異株のイネいもち病菌の野生型株 P131 胞子懸濁液 (1.0 x 105胞子/mL) が準備し、14-日齢の影響受けやすいの葉鞘に吹き付けて、5 d10湿室に保管された、CO 39 苗。P131 接種 CO 39 葉いもち病、典型的な堅牢な病変表示が、Com1 接種葉感染の明らかな欠陥を示した、完全な感染症 (図 2A) を引き出す可能性がありますいない.野生型株 P131 198818にする梁鵬して得られた株であります。MoKMT2H null 変異体 (ΔMoKMT2H) は、ターゲット遺伝子交換戦略11を使用して私たちのラボで曹操らによって得られました。Com1変異する梁鵬実習10陽らによって分離されました。
M. イネいもち病菌 ΔMoKMT2Hが傷によって宿主細胞を感染できるかどうかをチェックするには、経由で ΔMoKMT2Hスプレー法の菌糸のプラグまたは負傷の方法11で接種した野生型イネの葉をすり減り。P131/野生型ひずみ; に比べΔMoKMT2H感染の明らかな欠陥を明らかにされたΔMoKMT2Hを噴霧接種した葉ただし、経由 ΔMoKMT2H傷 (図 2A) 接種葉の明白な欠陥を認めた。植物感染オオムギ葉、健康または負傷した葉をさらにテストする (cv 黄金の約束) Com1、 ΔMoKMT2HP131 のそれぞれ、水滴の胞子や菌糸のプラグを接種しました。5 d 後接種で典型的なイネいもち病斑完全で開発していたΔMoKMT2Hまたは P131 株接種葉 Com1 変異体 (図 2 を接種し, 葉の少ない、小さい病変を認めB)。
図 1: 植物感染を示すスキーム。植物発芽したプラスチックの鉢に土で (50 mm2 × 50 mm 深く、排水の穴と)、2 つのポット、当たり種子、苗は温室で栽培されました。文化といもち病菌のイネいもち病菌の接種は、太田プレート上に成長しました。分生胞子噴霧接種法、分生胞子懸濁液は 0.02% (v/v) トゥイーン 20 ソリューションで中断し、米/オオムギ植物に噴霧します。傷接種法廃米/麦植物葉されたプラスチック板に置くし、菌糸プラグまたは分生子懸濁液を接種し。すべての処理植物の葉が暗培養 24 時間と 12 時間光培養します。最後に、3.6 cm2の単位内のコロニー数が記録されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Com1 と MoKMT2H 分生胞子形成とイネの葉に対する病原性に必要な。(A) 米の接種葉経由分生胞子スプレー (左) や (右)イネいもち病菌の野生型 P131 分生胞子と菌糸のプラグ、変異のCom1、やΔMoKMT2Hこのパネルが表示されます。典型的な葉は、すりむいたイネの葉に行われた菌糸プラグを介した接種後 7 d を認められました。典型的な病変は、菌糸のプラグを介した接種後 5 d を認められました。(B) オオムギ葉接種を介して分生子スプレー (左) または菌糸プラグ (右)。模擬治療コントロールとして 0.025% (v/v) トゥイーン 20 ソリューションの同じボリュームが散布されました。傷接種 P131 の図は、曹操らから変更されています。11. MoKMT2H子嚢菌の菌類である H3K4 H3K36 メチル化11が関与 Ash1 の機能。バー = 1 cm。Δcom1変異体病原性イネおよびオオムギ苗10の有意な低下。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| スケール | 説明 |
| 1 | ピン ポイント サイズの小さな黒い斑点 |
| 2 | 小さな少し細長い、壊死する丸みを帯びた灰色の斑点、異なる茶色の縁で、直径 1-2 mm 程度。病変は主に上部の葉に見られる |
| 3 | 病斑の型 2 のように同じですが、病変のかなりの数が上葉に |
| 4 | 典型的な影響を受けやすいいもち病斑、3 mm 以上長く、theleaf の面積の 4% 未満に感染 |
| 5 | 典型的な影響を受けやすいいもち病斑、3 mm 以上長く、感染葉面積の 4-10% 未満 |
| 6 | 典型的な影響を受けやすいいもち病斑、3 mm 以上長く、感染葉面積の 11-25% 未満 |
| 7 | 典型的な影響を受けやすいいもち病斑、3 mm 以上長く、感染葉面積の 26-50% 未満 |
| 8 | 典型的な影響を受けやすいいもち病斑、3 mm 以上長く、感染葉面積, 葉死者多数の 51 ~ 75% 未満 |
| 9 | 典型的な影響を受けやすいいもち病斑、3 mm 以上長く、葉面積の 75% 以上に感染 |
表 1: いもち病抵抗性のスコアリング システム。テーブルは、国際稲研究所 (IRRI) から引用されています。
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Discussion
植物病抵抗性遺伝子は、真菌病原体1,12を含む病原体による感染症の予防に不可欠な役割を果たします。いもち病は、病原体の人口構造の性質を理解して植物抵抗性遺伝子4を識別するためにモデルとして使用されています。したがって、病抵抗性遺伝子型と連続的に栽培することができます病気に強い植物を識別するために大規模な農業の植物の主な品種の非病原性遺伝子型を調べる必要があります。さらに、フィールド病原体の非病原性遺伝子型の利点は、抵抗性遺伝子型の異なるホスト品種12,13の合理的な流通をしなければなりません。しかし、現在の接種方法は一般的抵抗性と病原体同定14,15,16,17検診を妨げます。
植物の感染症検査の迅速かつ正確なメソッドを紹介します。この接種法は、繁殖試験と耐性遺伝子のクローニングの間に子孫の人口の表現型の抵抗性植物の識別に適しています。ここでは、負傷した植物を接種法のイネいもち病菌と葉を設立しました。宿主抵抗性は、病原体の拡散防止に大きな役割を果たしている、ためこの体外メソッド、テスト済みの米の傷を生んだ葉し傷口にイネいもち病を接種に直接感染の場合に便利です。葉の表皮組織と表皮の細胞壁を貫通することがなく葉。さらに、この接種法は異なる葉の年齢層に適しています。接種の結果が安定し正確です。分生胞子の少量のみ生産菌株の病原性を識別するために菌糸を接種接種を負傷のメソッドを使用できます。
このプロトコルは許可に抵抗し、そのホストの13の免疫を抑制する菌病原体固有の要因と同様、真菌に保存されている病原性のメカニズムの私達の理解にさらに貢献します。ただし、胞子の侵入と菌糸の拡張の率を決定する際、傷接種は適用されません。しかし、自然の状態で噴霧接種法はより病原体の病原性を反映します。噴霧接種法は操作が簡単、作業効率の向上に役立ちます。一緒に取られて、これらの結果は、審査に必要な正確で安定した接種法を示す植物抵抗性遺伝子と病原性を決定します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、北京農業大学 (YQ201603) の特別な科学研究プロジェクトと北京教育委員会 (KM201610020005) の科学的なプロジェクトによって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
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