عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن
Summary
تقدم هذه الدراسة إجراء التحقق من صحة والأمثل للعزلة والثقافة البشرية الخلايا اللحمية الرحم لإجراء الفحص في المختبر ديسيدواليزيشن. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة طريقة مفصلة لضربة قاضية كفاءة جين معين باستخدام سيرناس في الخلايا اللحمية الرحم البشرية.
Abstract
التفريق بين الخلايا البشرية stromal بطانة الرحم (هيسك) من ظهور مثل تنتجها الخلايا الليفية في أوروبية الافرازية تحول اللازمة لغرس الجنين في بطانة الرحم رحم الأم. تم إنشاء ديسيدواليزيشن غير لائق أنه سبب الجذري لعدم زرع وإجهاض الأجنة المبكرة اللاحقة. ولذلك، فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن مفيد لتحسين معدل الولادات الناجحة. كثيرا ما تحد في فيفو على أساس دراسات ديسيدواليزيشن الاصطناعية بسبب المعضلات الأخلاقية المرتبطة بالبحوث البشرية، فضلا عن مضاعفات متعدية الجنسيات في نماذج حيوانية. كنتيجة لذلك، غالباً ما تستخدم فحوصات في المختبر من خلال زراعة الخلايا الأولية لاستكشاف تحوير ديسيدواليزيشن عن طريق الهرمونات. وتوفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلاً لعزل هيس واللاحقة ديسيدواليزيشن الاصطناعية عن طريق مكملات الهرمونات إلى وسيلة تثقيف. علاوة على ذلك، توفر هذه الدراسة أسلوب مصممة تصميماً جيدا لضربة قاضية الجينات أي اهتمام باستخدام ترانسفيكشنز siRNA على أساس المادة الدهنية. ويسمح هذا البروتوكول الأمثل لنقاء الثقافة فضلا عن المحصول المنتج، مما يؤدي إلى تعظيم القدرة على استخدام هذا النموذج كوسيلة موثوق بها فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن، والتقدير الكمي اللاحقة وكلاء يفرز من الخلايا اللحمية الرحم ديسيدواليزيد.
Introduction
بين مرحلتي البلوغ وانقطاع الطمث، النساء في سن الإنجاب الخضوع لدورات شهرية لهرمون ينظم انتشار بطانة الرحم، والتمايز، وذرف اللاحقة في التحضير للحمل في عملية تعرف باسم الحيض1 ،2. هذه التعديلات المادية من بطانة الرحم البشرية ضرورية لغرس الجنين السليم داخل جدار الرحم1. تعديلات لبطانة الرحم، بما في ذلك التكيفات المورفولوجية والبيوكيميائية على حد سواء، هي وساطة طوال الدورة الشهرية عن طريق المبيض هرمونات الستيرويد الإستروجين والبروجسترون (P4)3،،من45. ضمن المرحلة التكاثري (أو الحبيبي)، مستويات الإستروجين بريوفولاتوري زيادة، الشروع في سماكة بطانة الرحم. بعد الإباضة، يعزز المرحلة الافرازية (أو اللواتي) ارتفاع كبير في تركيزات P4، الذي يحفز تحويل المورفولوجية للخلايا اللحمية الرحم (ESC) من ظهور مثل تنتجها الخلايا الليفية تقريب، الخلايا الظهارية مثل ديسيدوال في عملية تعرف باسم ديسيدواليزيشن،من46. تم إنشاء ديسيدواليزيشن غير لائق أنه سبب الجذري لعدم زرع واللاحقة المبكر الأجنة إجهاض4،،من78. ولذلك، فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء ديسيدواليزيشن مفيد للتشخيص والعلاج لفقدان الحمل المبكر.
حاليا، تستخدم عدة منهجيات لاستكشاف آثار ديسيدواليزيشن الكامنة في الخلايا اللحمية في بطانة الرحم. في فيفو، الرحم الماوس يمكن أن يتسبب مصطنع ديسيدواليزيشن عن طريق تحفيز الميكانيكية (أيخدش) أو النفط الحقن في رحم hormonally معبي9. متميزة من البشر، يعزز هذا التحفيز الاصطناعية التفريق بين التجويف الرحم بتوفير مظهر وجود الكيسة، خطوة ما مطلوب لبدء ديسيدواليزيشن في القوارض10،11. تبعاً لذلك، بسبب مضاعفات متعدية المرتبطة بنماذج حيوانية والمعضلات الأخلاقية المحيطة في فيفو على أساس الدراسات في البشر، أكثر بنجاح يتم دراسة نماذج ديسيدواليزيشن على أساس في المختبر.
في هذه الدراسة، يتم تجنيد المواضيع من خلال وضع إعلانات في كل الصحف المحلية الإنكليزية والإسبانية. تعرض المواضيع المحددة كمرشحين مناسبين لهذه الدراسة الاجتماع مع منسق البحوث، التي تناقش فيها الكشف كامل عن المخاطر المحتملة. عند التأكد فهم كامل للمخاطر المحتملة التي ينطوي عليها، هو تحقيق موافقة المواضيع في الأشكال الكتابية والشفوية على حد سواء. موافقة هذا الموضوع يتضمن الإذن (1) يخضع تخزين بالفصاده (2) طويلة الأجل على الأنسجة لأغراض البحث في المستقبل و (3) الموافقة على إنشاء ثقافات الأولية من عينات الأنسجة التي تم جمعها. وعقب موافقة، تعطي المواضيع نموذج لإكمال في أي الهوية المسموح بها من العرق/الإثنية و/أو الحق لاوقع. من المقرر زيارة لاحقة لتحقيق خزعة بطانة الرحم استناداً إلى دورة الطمث في هذا الموضوع. المتطوعين المعينين لهذه الدراسة تعكس التركيبة السكانية الإثنية والعرقية من منطقة العاصمة سانت لويس وموثقة من قبل تعداد عام 2012 ولا ينطوي على مشاركة أي مجموعة من السكان الضعيفة بما في ذلك النساء الحوامل والأجنة والأجنة، الأطفال دون سن 18 سنة من العمر، أو غيرهم من الفئات الضعيفة. وتشمل شروط الأهلية للمشاركة في جمع عينة خزعة (1) يجري تتراوح أعمارهم ما بين 18-45 سنة (2) وجود دورات الحيض العادية (25-32 يوما) (3) وجود لا الحمل الحالي أو استخدام وسائل منع الحمل الهرمونية/داخل الرحم الجهاز لمدة 30 يوما قبل التسجيل (4) وجود لا عدوى مهبلية الحالية أو الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي (5) وجود لا علاجات المضادات الحيوية الحالية، و (6) وجود لا اختبار بابانيكولاو الشاذ الحالي.
ضمن هذه الدراسة، مثقف وفعل مصطنع للخضوع ديسيدواليزيشن في المختبر عن طريق مكملات الهرمونات (استراديول (E2)، بروجستيرون (الآلام والكروب الذهنية)، ودوري الادينوسين الخلايا البشرية stromal بطانة الرحم (هيس) الأدينوزين (مخيم)) إلى المتوسط. في هذا الأسلوب، يتم تبديل درجة ديسيدواليزيشن تستند على العدد الإجمالي لأيام علاج الهرموني. بالتزامن مع إعادة ترتيب سيتوسكيليتال، يستحث مكملات هرمونية التعديلات البيوكيميائية التي تجربة decidual الخلايا الافرازية مثل الصفات2،4. التعبير عن الجينات السمة المميزة، مثل البرولاكتين (PRL) والبروتين مثل الأنسولين عامل النمو 1 (IGFBP1)، يمكن أن تستخدم لتأكيد وتقدير درجة هيس ديسيدواليزيشن5،12، 13 , 14-الأهم من ذلك، يتضح أيضا استمرارية هذا البروتوكول القيام بضربه قاضية الجينات المحددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
دورة الطمث الإنجابية الإناث تتميز بارتفاع مستويات البروجسترون طوال الحيض، مما يحفز ديسيدواليزيشن من المفتاح ESC في الخلايا الافرازية جولة, طلائي مثل3،8. الشروع في ديسيدواليزيشن من الأنواع التابعة. في البشر، ويحدث ديسيدواليزيشن تلقائياً عند ارتفاع تركيز ال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
Riferimenti
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
